זיהום של תאי אפיתל אף ראשוניים הגדלים בממשק אוויר-נוזל כדי לאפיין אינטראקציות אנושיות בין נגיף הקורונה למארח
Summary
אפיתל האף הוא אתר המחסום העיקרי בו נתקלים כל הפתוגנים הנשימתיים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לשימוש בתאי אפיתל אף ראשוניים שגודלו כתרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי לאפיין אינטראקציות אנושיות בין נגיף הקורונה למארח במערכת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית.
Abstract
שלושה נגיפי קורונה אנושיים פתוגניים ביותר (HCoVs) – SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) ו- SARS-CoV-2 (2019) – הופיעו וגרמו למשברים משמעותיים בבריאות הציבור ב -20 השנים האחרונות. ארבעה HCoVs נוספים גורמים לחלק משמעותי ממקרי הצטננות בכל שנה (HCoV-NL63, -229E, -OC43 ו-HKU1), מה שמדגיש את החשיבות של חקר הנגיפים האלה במערכות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. HCoVs נכנסים לדרכי הנשימה ויוצרים זיהום באפיתל האף, האתר העיקרי בו נתקלים כל הפתוגנים הנשימתיים. אנו משתמשים במערכת תרבית אפיתל אף ראשונית שבה דגימות אף שמקורן במטופל גדלות בממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן באתר זקיף חשוב זה. תרביות אלה משחזרות מאפיינים רבים של דרכי הנשימה in vivo , כולל סוגי התאים הנוכחיים, תפקוד ריסוני וייצור ריר. אנו מתארים שיטות לאפיון שכפול נגיפי, טרופיזם של תאים מארחים, ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי וירוסים והשראת חיסון מולדת בתרביות ALI באף לאחר זיהום HCoV, תוך שימוש בעבודה שנערכה לאחרונה המשווה בין HCoVs קטלני ועונתי כדוגמה1. להבנה מוגברת של אינטראקציות מארח-פתוגן באף יש פוטנציאל לספק מטרות חדשות לטיפולים אנטי-ויראליים נגד HCoVs ונגיפים נשימתיים אחרים שסביר להניח שיופיעו בעתיד.
Introduction
שבעה נגיפי קורונה אנושיים (HCoVs) זוהו עד כה וגורמים למגוון מחלות נשימה2. HCoVs נפוצים או עונתיים (HCoV-NL63, -229E, -OC43 ו-HKU1) קשורים בדרך כלל לפתולוגיה של דרכי הנשימה העליונות וגורמים לכ-10%-30% ממקרי ההצטננות בשנה. למרות שזהו הפנוטיפ הקליני הטיפוסי הקשור ל- HCoVs הנפוץ, וירוסים אלה יכולים לגרום למחלות משמעותיות יותר בדרכי הנשימה התחתונות באוכלוסיות בסיכון, כולל ילדים, מבוגרים ואנשים מדוכאי חיסון 3,4. שלושה HCoVs פתוגניים הופיעו וגרמו למצבי חירום משמעותיים בתחום בריאות הציבור ב-20 השנים האחרונות, כולל תסמונת נשימה חריפה חמורה (SARS)-CoV, תסמונת הנשימה המזרח תיכונית (MERS)-CoV ו-SARS-CoV-2. HCoVs קטלניים קשורים לפתולוגיה חמורה יותר של דרכי הנשימה, אשר מודגמת בבירור על ידי שיעור התמותה של >34% הקשור למקרי MERS-CoV (894 מקרי מוות מיותר מ -2,500 מקרים מאז הופעתו בשנת 2012)5,6. חשוב לציין כי HCoVs קטלני גורם גם למגוון מחלות בדרכי הנשימה, החל מזיהומים אסימפטומטיים ועד דלקת ריאות קטלנית, כפי שניתן לראות עם מגיפת COVID-19 המתמשכת7.
HCoVs, כמו פתוגנים נשימתיים אחרים, נכנסים לדרכי הנשימה ויוצרים זיהום פרודוקטיבי באפיתל האף8. התפשטות לדרכי הנשימה התחתונות נחשבת קשורה לשאיפה מחלל הפה/אף לריאה, שם HCoVs גורם לפתולוגיה משמעותית יותר של דרכי הנשימה התחתונות 9,10,11. לפיכך, האף משמש כשער הראשוני לכניסה נגיפית והוא המחסום העיקרי לזיהום באמצעות מנגנון פינוי הליחה החזק שלו ומנגנוני החיסון המולדים הייחודיים שמטרתם למנוע התפשטות נגיפית נוספת לדרכי הנשימה התחתונות12,13. לדוגמה, תאי אפיתל האף דווחו כמבטאים רמות בסיסיות גבוהות מהממוצע של אינטרפרונים אנטי-ויראליים וגנים מעוררי אינטרפרון, דבר המצביע על כך שתאי האף עשויים להיות מוכנים לתגובות מוקדמות לנגיפים נשימתיים14,15,16.
בעבר השתמשנו בתאי אפיתל אף ראשוניים שמקורם במטופל שגודלו בממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי למדל אינטראקציות HCoV-מארח באף, היכן שמתחילות זיהומי HCoV. תרביות ALI באף מתירניות הן לפתוגניות (SARS-CoV-2 ו-MERS-CoV) והן ל-HCoVs נפוצות (HCoV-NL63 ו-HCoV-229E) ומציעות יתרונות שונים על פני קווי תאי אפיתל מסורתיים של דרכי הנשימה כגון A549 (קו תאי אדנוקרצינומה של ריאות)16,17. לאחר ההתמיינות, תרביות ALI באף מכילות אוכלוסיית תאים הטרוגנית ומציגות רבים מהתפקודים המצופים מאפיתל האף in vivo, כגון מנגנון פינוי ליחה18. לתאי האף יש גם יתרונות על פני מערכות תרבית דרכי נשימה נמוכות יותר (כגון תאי אפיתל סימפונות אנושיים, HBECs), שכן רכישת תאי אפיתל באף באמצעות צחצוח ציטולוגי היא הרבה פחות פולשנית בהשוואה לשימוש בטכניקות כגון ברונכוסקופיה להשגת HBECs 19,20,21.
מאמר זה מתאר שיטות לשימוש במערכת תרבית אף זו כדי לאפיין אינטראקציות HCoV-מארח באפיתל האף. יישמנו שיטות אלה בעבודות שפורסמו לאחרונה כדי להשוות SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 ו- HCoV-229E 1,16,17. למרות ששיטות אלה ותוצאות מייצגות מדגישות את המחקר של HCoVs במודל תאי אף זה, המערכת ניתנת להתאמה גבוהה ל- HCoVs אחרים, כמו גם לפתוגנים נשימתיים אחרים. יתר על כן, שיטות אלה יכולות להיות מיושמות באופן רחב יותר במערכות תרבית אחרות של ALI על מנת לחקור שכפול נגיפי וטרופיזם תאי, כמו גם ציטוטוקסיות והשראת חיסון מולדת לאחר זיהום.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המפורטות כאן מתארות מערכת תרבית אפיתל ראשונית שבה תאי אפיתל אף שמקורם במטופל גדלים בממשק אוויר-נוזל ומיושמים בחקר אינטראקציות HCoV-מארח. לאחר התמיינותן, תרביות ALI אפיפיוריות אף אלה משחזרות מאפיינים רבים של אפיתל האף in vivo , כולל אוכלוסייה תאית הטרוגנית עם תאים ריסניים, גביעים ותא?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
למחקר זה יש את מקורות המימון הבאים: המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. ו- N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. ו- N.A.C.), מרכז פן לחקר וירוסי קורונה ופתוגנים מתעוררים אחרים (S.R.W.), קרן Laffey-McHugh (S.R.W. ו- N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022)
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
