JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Выделение ядер из замороженной ткани печени для одноклеточной мультиомики

Published: December 09, 2022
doi:
10.3791/64792
, , ,
1Helmholtz Pioneer Campus (HPC),Helmholtz Munich, 2Institute of Computational Biology, Computational Health Department,Helmholtz Munich, 3Division of Infectious Diseases and Tropical Medicine,Ludwig-Maximillian-Universität Klinikum, 4TUM School of Medicine,Technical University of Munich

Summary

Здесь мы представляем протокол выделения ядер из замороженных, архивных тканей печени для одноядерной РНК-seq, ATAC-seq и совместной мультиомики (RNA-seq и ATAC-seq).

Abstract

Печень представляет собой сложную и гетерогенную ткань, ответственную за выполнение многих критических физиологических функций, таких как поддержание энергетического гомеостаза и метаболизм ксенобиотиков, среди прочих. Эти задачи выполняются за счет тесной координации между печеночными паренхиматозными и непаренхиматозными клетками. Кроме того, различные метаболические активности ограничены определенными областями печеночной дольки – явление, называемое зонацией печени. Последние достижения в технологиях секвенирования одной клетки позволили исследователям исследовать гетерогенность тканей при разрешении одной клетки. Во многих сложных тканях, включая печень, жесткие ферментативные и /или механические протоколы диссоциации могут негативно повлиять на жизнеспособность или качество одноклеточных суспензий, необходимых для всесторонней характеристики этого органа в здоровье и заболевании.

В этой статье описывается надежный и воспроизводимый протокол выделения ядер из замороженных, архивных тканей печени. Этот метод дает высококачественные ядра, совместимые с последующими одноклеточными омическими подходами, включая одноядерную РНК-seq, анализ на транспозазно-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq), а также мультимодальные омики (совместные RNA-seq и ATAC-seq). Этот метод был успешно использован для выделения ядер из здоровых и больных образцов замороженной печени человека, мыши и нечеловека приматов. Этот подход позволяет объективно выделить все основные типы клеток в печени и, следовательно, предлагает надежную методологию изучения печени с одноклеточным разрешением.

Introduction

Одноклеточная геномика быстро становится важной методологией для изучения функции печени и оценки влияния клеточной гетерогенности на здоровье и заболевания1. Быстрое развитие «мультиомики» для одновременного измерения различных слоев информации и параллельное расширение надежных вычислительных конвейеров прокладывает путь к открытию ранее неизвестных типов и подтипов клеток в нормальной и больной печени2.

Возможность изучения биобанков и архивных замороженных образцов значительно расширила возможности для пересмотра и открытия роли непаренхимальных клеток 3,4,5 и исследования роли полиплоидных гепатоцитов при старении и при хронических заболеваниях 6,7,8,9 . Таким образом, в данной работе описывается надежный и воспроизводимый протокол изоляции одного ядра для замороженных во вспышках (FF) архивных печени, который совместим с последующим секвенированием одноядерной РНК и секвенированием ATAC, а также с мультимодальными омиками (совместные RNA-seq и ATAC-seq) (рисунок 1).

Этот рабочий процесс позволяет исследовать транскриптом и доступность хроматина для всех типов клеток в печени, независимо от размера или хрупкости клеток, в протоколах ферментативной диссоциации. Он может быть выполнен с небольшими срезами тканей (15-30 мг или 5-10 мм3) из драгоценных образцов человека или трансгенных мышей. Определение высокой чистоты выделения ядер включает в себя количественную оценку и измерение размера ядра, который может коррелировать с увеличением размера клеток и старением10,11, и эта чистота актуальна для анализа как плоидии гепатоцитов12, так и клеточных размер-зависимых транскрипционных механизмов 11,13,14,15 . Кроме того, ядра, выделенные из замороженной печени, сохраняют ценную информацию о зонировании печени. Рабочий процесс и сбор тканей позволяют валидировать данные одноклеточной геномики или дальнейшие дополнительные анализы, такие как иммуногистохимия или пространственная транскриптомика из одной и той же ткани и одного и того же человека. Таким образом, этот подход может быть применен к множественным заболеваниям печени и моделировать организмы систематически и надежно.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с немецким законодательством о благополучии животных и правилами правительства Верхней Баварии. Содержание животных было одобрено в соответствии с § 11 Закона Германии о благополучии животных и выполнено в соответствии с Директивой 2010/63 /EU. 1. Тканевая подготовка Принесите в жертву 3-месячного до 22-месячного самца мыши C57BL/6J из-за вывиха шейки матки. Уложите животное на рассекательную доску, закрепите конечности булавками и продезинфицируйте живот 70% этанолом. Выполняйте некропсию в соответствии с рекомендациями Treuting et al.16.Откройте живот до грудной клетки, визуализируйте печень и используйте щипцы, чтобы аккуратно удалить печень без прокалывания долек. Извлеките неповрежденную печень, удерживая диафрагму щипцами и удаляя соединительную ткань ножницами. Промыть орган холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), вытереть его насухо на чистом бумажном полотенце и разрезать дольки печени на несколько частей для разных целей: FF для одноядерной изоляции и мультиомики; параформальдегид-фиксированный (10% PFA) для встраивания парафина; и/или встраивается в соединение с оптимальной температурой резания (OCT) для дальнейшего гистологического анализа (рисунок 1A). Аликвотирует кусочки печени в криовиалы или 5 мл завинчивающиеся трубки и сразу же мгновенно замораживается в жидком азоте. Храните замороженные образцы печени при температуре −80 °C для последующих экспериментов с одноядерной мультиомикой (рисунок 1B, C).ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервированная ткань может безопасно храниться при температуре −80 °C в течение нескольких лет и всегда должна транспортироваться на сухом льду при −80 °C перед использованием. 2. Выделение ядер Настольная очистка и подготовка буферов и расходных материаловОчистите рабочие столешницы и пипетки 70% раствором для обеззараживания этанолом и РНКазой или используйте специальные настольные панели и материалы без РНКазы. Предварительно оградите как качающийся ковш, так и центрифуги с фиксированным углом, трубки 1,5 мл / 2 мл и многоскважинные пластины до 4 ° C, как подробно описано ниже. Предварительно оставьте одноразовый пинцет без РНК, используемый для обработки тканей, одноразовый стерильный скальпель и чашку Петри на сухом льду (−60 °C). Предупредите гомогенизатор стекла Dounce и пестики на льду (4 °C). Поместите каждый пестик (A и B) в трубку объемом 5 мл, чтобы избежать прямого контакта со льдом и потенциального загрязнения РНКазой. Готовят раствор разбавителя среды йодиксанола (ИДМ) (таблица 1А) и используют его для получения 50% и 29% разведений 60% среды градиента плотности запаса йодиксанола (таблица 1В и таблица 1С соответственно). Предварительно отложите все трубки. Для каждого образца, который будет обрабатываться, подготовьте следующие пробирки:Подготовьте три 1,5 мл низкодневносвязывающих пробирок (одна для отфильтрованного тканевого гомогената, вторая, содержащая 250 мкл 50% разведения раствора йодиксанола, и третья для чистой суспензии ядер). Готовят одну трубку круглого дна объемом 2 мл, содержащую 500 мкл 29% разбавления раствора йодиксанола для разделения градиента плотности. Подготовьте одну коническую трубку объемом 15 мл для среды выделения ядер-2 (NIM-2) и буфера гомогенизации (HB). Подготовьте среду выделения ядер-1 (NIM-1) (таблица 1D) и используйте ее для получения NIM-2 (таблица 1E) и, впоследствии, HB (таблица 1F). Добавьте оба ингибитора РНКазы непосредственно перед использованием, как описано ниже в протоколе. Подготовьте буфер хранения ядер (NSB), как описано в таблице 1G. Добавьте рекомбинантный ингибитор РНКАЗы непосредственно перед использованием. Добавьте ингибитор РНКазы на основе белка в NSB перед использованием для сортировки FACS (необязательно). Подготовьте стакан емкостью 500 мл со стерильной водой для замачивания гомогенизаторов и пестиков Dounce после гомогенизации ткани для оптимальной очистки и обслуживания гомогенизаторов. Гомогенизация тканейВырежьте кусок ткани 20-30 мг (или 5 мм3) предварительно охлажденным скальпелем внутри чашки Петри на сухом льду. Затем сразу же перенесите чашку Петри на влажный лед (4 °C). Добавьте 1 мл HB и, используя холодный скальпель, измельчите ткань как можно больше, чтобы ее можно было легко аспирировать с помощью широкофюзеляжного наконечника 1 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте широкофюзеляжные наконечники для переноса всех тканей/ядер. В качестве альтернативы наконечники объемом 1 мл можно разрезать стерильным скальпелем на стерильной пластиковой крышке для создания широких отверстий (рисунок 2А). Соберите тканевую суспензию и перенесите ее в предварительно охлажденный гомогенизатор Dounce из стекла объемом 2 мл (рисунок 2B). Вымойте чашку Петри дополнительными 0,5-1 мл HB и соберите все оставшиеся кусочки ткани, сохраняя все на льду. Медленно и осторожно сделайте пять ударов рыхлым пестиком А по льду. Избегайте создания пузырьков, используя скручивающие движения пестика при подтягивании его вверх и вниз. Убедитесь, что пестик осторожно перемещается сверху вниз гомогенизатора с каждым ударом. Впоследствии выполните 10-15 медленных ударов тугой пестикой В на льду. Избегайте создания пузырьков.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется визуально осмотреть ядра под микроскопом после 10 ударов пестиком B , чтобы выяснить, нужно ли больше ударов. Сделайте это с помощью окрашивания трипана синим цветом (соотношение трипана к образцу 1:1) и ручного гемоцитометра (например, смешайте 10 мкл трипан-синего с 10 мкл суспензии ядер и используйте 10 мкл смеси для исследования под микроскопом; Рисунок 2С). Фильтруйте гомогенат через клеточный сетчатый фильтр 50 мкм, перемещая его в предварительно охлажденную трубку объемом 1,5 мл. Используйте более одного фильтра и/или трубки для гомогенатов, содержащих большое количество соединительнотканных сгустков. Промыть гомогенизатор и используемые фильтры с дополнительными 0,5-1 мл HB, чтобы тщательно собрать весь гомогенат ткани. Переходим к центрифугированию градиента плотности. Центрифугирование градиента плотностиЦентрифуга фильтрованного гомогената в предварительно охлажденной центрифуге с фиксированным углом наклона при 1000 × г в течение 8 мин при 4 °C. Пока образец вращается, приготовьте пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 250 мкл 50% разведения йодиксанола, и одну трубку объемом 2 мл, содержащую 500 мкл 29% разведения йодиксанола. Держите обе трубки на льду. После центрифугирования аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу с помощью вакуумного насоса.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ручного пипетирования поставит под угрозу качество конечной суспензии ядер. Добавьте 250 мкл HB к грануле, используя наконечник пипетки с широким отверстием 1 мл, и очень медленно повторно суспендируйте. Перенесите 250 мкл суспензии ядер в предварительно охлажденную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 250 мкл 50% разведения йодиксанола, и перемешайте осторожно, но тщательно, чтобы получить 25% суспензии йодиксанола/ядер. Перенесите 500 мкл 25% суспензии йодиксанола/ядер в предварительно охлажденную трубку объемом 2 мл, содержащую 500 мкл 29% разведения йодиксанола.ПРИМЕЧАНИЕ: 500 мкл 25% суспензии йодиксанола/ядер следует осторожно наносить поверх 500 мкл 29% раствора йодиксанола таким образом, чтобы смеси 25%/29% йодиксанола демонстрировали четкое разделение фаз. Используйте боковую часть стенки трубки с наконечником пипетки, расположенным под углом 45°, чтобы создать этот градиентный интерфейс. С этого момента с трубкой необходимо обращаться осторожно, чтобы не нарушить этот градиент. Центрифугируйте трубку в предварительно охлажденной центрифуге с качающимся ведром при 12 500 г в течение 20 мин с тормозом, установленным на ВЫКЛ. Непосредственно перед завершением стадии центрифугирования добавьте ингибиторы РНКазы в буфер NSB при переходе к трубопроводам scRNA-seq (см. Таблицу 1G). После центрифугирования аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу с помощью вакуумного насоса.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ручного пипетирования поставит под угрозу качество конечной суспензии ядер. Используя наконечник пипетки с широким отверстием объемом 1 мл, осторожно повторно суспендируйте гранулу в 100-300 мкл NSB и перенесите суспензию ядер в чистую, предварительно охлажденную трубку объемом 1,5 мл. Подсчитайте ядра с помощью раствора трипана синего цвета (соотношение трипана к образцу 1:1) и ручного гемоцитометра (например, смешайте 10 мкл трипанового синего с 10 мкл суспензии ядер и используйте 10 мкл смеси для подсчета; Рисунок 2D). Используйте полученную суспензию ядер сразу для одноядерного геномного анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензия ядер в NSB может храниться в холодильнике при 4 °C в течение 1 недели для дальнейшего анализа с помощью проточной и/или визуализационной проточной цитометрии, но не для snRNA-seq или snATAC-seq. 3. Сортировка ядер для профилирования плоидии гепатоцитов или обоснованных подходов к секвенированию Для сортировки клеток на основе проточной цитометрии отфильтруйте суспензию ядер через фильтр 50 мкм в предварительно охлажденную трубку FACS объемом 5 мл. Используйте сортировщик проточной цитометрии, оснащенный соплом 100 мкм. Загрузите трубку FACS в сортировщик и просмотрите образец. Настройте стратегию гатинга для сортировки ядер, начиная с затвора рассеяния, построив прямую область рассеяния против области бокового рассеяния (FSC-A / SSC-A), затем Hoechst-Height против Hoechst-Area (nuechs gate), а затем Hoechst-Width против Hoechst-Area (singlets gate). Визуализируйте профиль плоидности ядер на гистограмме области Хёхста.ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего пикового разрешения визуализируйте канал Hoechst (450/50) на линейной шкале (рисунок 3A). Для сортировки по 96-/384-луночным пластинам устанавливают задержку капель и оптимизируют выравнивание пластин колориметрическим методом с бензидиновым субстратом -пероксидазой хрена (TMB-HRP), как описано ранее6. Установите охлаждение образца и держатель пластины на охлаждение при 4 °C, при этом вращение образца включается при 300 оборотах в минуту. Сортируйте одиночные ядра при концентрации образца ~1 х 105 ядер/мл и со скоростью потока при 200-500 событий/с. 4. Визуальный осмотр и количественная оценка ядерных параметров с помощью визуализационной цитометрии (опционально) Загрузить трубку объемом 0,5 мл, содержащую 50 мкл суспензии ядер в концентрации 2 × 107 ядер/мл. Настройте затвор всех событий на основе соотношения сторон по отношению к флуоресцентному каналу Хёхста для визуализации профиля плоидности ядер (рисунок 3B). Получите образец с 40-кратным увеличением, используя brightfield (BF) и флуоресцентный канал Hoechst. Проверьте и количественно оцените ядра 2n и 4n с использованием измерения яркого поля и интенсивности флуоресценции Hoechst с помощью программного обеспечения для визуализации цитометрии (рисунок 3C). 5. Построение и секвенирование одноядерной RNA-seq, ATAC-seq или многокупольной библиотеки Для подходов snRNA-seq на основе капель загружайте очищенную суспензию ядер непосредственно в микрофлюидное устройство для автоматического параллельного разделения и молекулярного штрих-кодирования17. После того, как микрофлюидный прогон завершен в одноклеточном устройстве для разделения, соберите ядра, инкапсулированные гелем, инкубируйте и очистите, как описано ранее в руководящих принципах17 производителя. Выполните 11 циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР) для предварительного уплотнения кДНК, используя следующую программу: 3 мин при 98 °C (15 с при 98 °C, 20 с при 63 °C и 1 мин при 72 °C) x 11, 1 мин при 72 °C и держите при 4 °C. Продолжение конечного ремонта и А-хвостовой ступени и перевязки адаптера, как указано производителем17. Для последующего окончательного построения библиотеки экспрессии генов выполните 10 циклов ПЦР с использованием следующей программы: 45 с при 98 °C (20 с при 98 °C, 30 с при 54 °C, 20 с при 72 °C) x 10, 1 мин при 72 °C и держите при 4 °C. Упорядочивайте полученные библиотеки до глубины считывания ~20 000-50 000 средних считываний на ядро. Для совместного мультиомического (РНК + ATAC) секвенирования на основе капель инкубируют ядра печени в буфере лизиса в течение 5 мин, а затем маркируют их в течение 1 ч, как описано ранее18. Загрузите помеченные ядра непосредственно в микрофлюидное устройство для автоматического параллельного разделения и молекулярного штрих-кодирования. После того, как микрофлюидный прогон завершен, соберите ядра, инкапсулированные гелем, инкубируйте и очистите, как описано производителем18. Выполните шесть циклов ПЦР для стадии преамплификации кДНК, используя следующую программу: 5 мин при 72 °C, 3 мин при 98 °C (20 с при 98 °C, 30 с при 63 °C, 1 мин при 72 °C) x 6, 1 мин при 72 °C и держите при 4 °C. Возьмите 35 мкл предварительно усыпленного образца и выполните усиление кДНК следующим образом: 3 мин при 98 °C (15 с при 98 °C, 20 с при 63 °C, 1 мин при 72 °C) x 6, 1 мин при 72 °C и держите при 4 °C. Продолжить с окончанием ремонта и А-хвостовой ступенью и перевязкой адаптера, как указано производителем18 . Для последующей окончательной индексации образца ПЦР выполните 15 циклов ПЦР следующим образом: 45 с при 98 °C (20 с при 98 °C, 30 с при 54 °C, 20 с при 72 °C) x 15, 1 мин при 72 °C и держите при 4 °C. Для построения библиотек ATAC используйте 40 мкл и амплифицируйте в течение шести циклов ПЦР для индексации образцов с помощью следующей программы: 45 с при 98 °C (20 с при 98 °C, 30 с при 67 °C, 20 с при 72 °C) x 6, 1 мин при 72 °C и держите при 4 °C. Секвенируйте полученные мультиомные библиотеки экспрессии генов до минимальной глубины считывания 20 000 пар чтения на ядро, а мультиомные библиотеки ATAC — до минимальной глубины считывания 25 000 пар чтения на клетку, как рекомендовано производителем18.

Representative Results

Этот рабочий процесс выделения одного ядра из замороженных образцов печени адаптирован для одноядерной мультиомики и опирается на три основных этапа, которые можно резюмировать следующим образом: i) сбор образцов для параллельного анализа клеточной гетерогенности и архитектуры тканей, ii) одноядерная суспензия и iii) одноядерная мультиомика (рисунок 1). ). Экстрагированная печень препарируется у усыпленных мышей и разрезается на кусочки для гистологического осмотра для встраивания парафина, криосекции или того и другого. Другие разрезанные куски немедленно замораживаются во флеш-фазе в жидком азоте для последующей одноядерной изоляции для мультиомического анализа. Эта система сбора тканей позволяет пользователю дополнительно проверять данные одноядерной омики на участках тканей одного и того же человека, тем самым дополняя набор данных пространственной транскриптомикой или иммуногистохимическим анализом, если это необходимо. Микроскопическое исследование ядер, извлеченных из замороженной печени описанным здесь способом, показывает, что стадия центрифугирования градиента плотности значительно облегчает удаление нежелательных клеточных и тканевых обломков (рисунок 2C,D). Кроме того, эта методология сохраняет все уровни плоидности, которые могут быть проверены и количественно определены с помощью цитометрического анализа (рисунок 3). Для дальнейшей проверки производительности этого протокола мы провели snRNA-seq на основе капель на несортированных и отсортированных FACS ядрах и проанализировали данные по конвейеру Seurat. Короче говоря, извлеченные одиночные ядра были подготовлены для snRNA-seq на основе капель, как описано ранее19. Для snRNA-seq ядер 2n и 4n или более высоких уровней плоидии было использовано 11 циклов для стадии амплификации кДНК и 10 циклов для окончательного построения библиотеки экспрессии генов. Полученные библиотеки были секвенированы до глубины считывания ~25 000-39 000 средних считываний на ядро. Полученные показания одиночных ядер были сопоставлены с геномом мыши GRCm39/mm39. При запуске конвейера предварительной обработки была добавлена команда –include-intron для определения включения и количественной оценки неспликированной матричной РНК (мРНК), присутствующей в ядрах. Алгоритм EmptyDrops , встроенный в элайнер, отфильтровал и удалил пустые капли. Пакет R Seurat (версия 4.1.1) использовался для вычисления метрик контроля качества (QC) с использованием матрицы подсчета уникальных молекулярных идентификаторов (UMI), выведенной конвейером анализа snRNA-seq. Были удалены подсчеты с менее чем 100 признаками (генами) и менее 10 клетками. Ядра были отфильтрованы в соответствии с выявленными порогами КК: минимальное количество генов = 200 и максимальное количество генов = 8000, митохондриальная фракция <1% и рибосомная фракция <2%. Топ-3000 высоковариабельных генов (HVG) были использованы для анализа главных компонентов (PCA), реализованного в Seurat. Кластеризация на основе графов была выполнена после ввода верхних 15 измерений ПК в результате анализа PCA. Для кластеризации ячеек мы применили метод оптимизации модульности (алгоритм Лувена) с параметром разрешения, установленным равным 0,5. Чтобы визуализировать и исследовать этот набор данных, мы выполнили нелинейное уменьшение размеров, а именно равномерное многообразное приближение и проекцию (UMAP). Идентичность каждого кластера была назначена на основе предварительных знаний маркерных генов 6,20,21. На рисунке 4А показаны высококачественные метрики из данных, полученных с помощью этого метода извлечения ядер. UMAP представляет собой количество подсчетов во всех ядрах и основных типах клеток, которые могут быть уверенно идентифицированы только с помощью ядерного транскриптома и относительно неглубокого секвенирования (~ 25 000-40 000 средних считываний на клетку) (рисунок 4B). Этот подход позволяет исследовать специфические для печени факторы транскрипции, такие как Hnf4a, Mlxipl и Ppara, а также гены-мишени, участвующие в метаболизме ксенобиотиков (т.е. Cyp2e1 и Cyp2f2) (рисунок 4C). Следует отметить, что извлеченные ядра сохранили критическую информацию о зонировании печени, о чем свидетельствует комплементарный паттерн генов отличительных признаков, таких как перицентральный Cyp2e1 и перипортальный Cyp2f2 (рисунок 4C). Мы также оценили совместимость несортированных ядер, извлеченных с использованием этого метода, с более новыми мультиомическими анализами для одновременного профилирования эпигеномного ландшафта (ATAC) и экспрессии генов (РНК) в одних и тех же одиночных ядрах18. Мы оптимизировали время инкубации лизиса ядер до 5 мин до транспозиции. Библиотеки секвенирования были построены путем запуска шести циклов ПЦР для преамплификации кДНК. Из предварительно усыпленного образца брали 35 мкл и дополнительно амплировали 15 циклами ПЦР для индексации образца для построения библиотеки экспрессии генов. Репрезентативная электроферограмма следа кДНК показана на рисунке 5А (вверху). Для построения библиотек ATAC было использовано 40 мкл преамплифицированного образца, которое было запущено для дополнительных шести циклов ПЦР для индексации образцов с репрезентативной электроферограммой следа ДНК, показанной на рисунке 5A (внизу). Полученная библиотека экспрессии генов (РНК) была секвенирована на глубину 44 600 считываний на ядро, а библиотека ATAC — на глубину 43 500 считываний на ядро (рисунок 5B). Подобно описанному выше, одномодальному протоколу секвенирования на основе капель, сопоставление считывания, выравнивание, удаление пустых капель и подсчет фрагментов выполнялись в соответствии со стандартными рекомендациями, как описано ранее, с использованием эталонного генома GRCm39/mm3918. Используя пакеты22 Seurat и Signac, мы выполнили анализ «взвешенного ближайшего соседа» (WNN) для множественных измерений обеих модальностей (РНК + ATAC) (рисунок 5C), что позволило нам идентифицировать и аннотировать как основные, так и второстепенные типы клеток печени без заметных смещений из-за размера клеток или ядерной хрупкости (рисунок 5D). Конвейер, опубликованный лабораторией Satija22,23, включает в себя стандартные этапы предварительной обработки и уменьшения размеров, выполняемые на обоих анализах независимо друг от друга. Чтобы иметь хорошее представление о взвешенной комбинации модальностей RNA-seq и ATAC-seq, график WNN был построен и использован для визуализации, кластеризации и аннотации UMAP на основе ранее идентифицированных маркерных генов 6,20,21. Подобно анализам с использованием одной модальности, мы также обнаружили регуляторы транскрипции (Hnf4a, Ppara, Mlxipl) и отличительные гены зонирования печени (Hamp, Cyp2e1 и Cyp2f2) (рисунок 5E). Рисунок 1: Экспериментальный обзор, рабочий процесс и одноклеточные геномные приложения. (A) Иллюстративное представление образца ткани для гистологии (слева, три секции выбраны для встраивания парафина и / или криосечения), коллекция замороженных тканей для одноклеточной геномики (средняя) и репрезентативная иммуногистохимия и иммунофлуоресцентный анализ (справа); шкала bar = 100 мкм. (B) Критические шаги для высококачественных одноядерных суспензий. (C) Суспензии ядер могут быть загружены на 10-кратный хромовый чип или использованы для сортировки FACS и подходов на основе пластин. Сокращения: H&E = гематоксилин и эозин; DAPI = 4′,6-диамидин-2-фенилиндол; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Рассечение печени и гомогенизация стеклянной ткани Dounce. (A) Репрезентативная мышиная печень 3-месячной мыши C57BL6/J (слева); участок печени, используемый для одноядерных выделений до (посередине) и после измельчения ткани скальпелем (справа). Шкала стержней = 1 см. (B) Иллюстративные изображения гомогенизации 2 мл dounce-glass до штрихов с «рыхлым» пестиком A (слева) и после «тугогого» пестика B (справа). Мониторинг гомогенизации тканей с помощью гемоцитометра (С) до градиентного центрифугирования и (D) после градиентного центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Флуоресцентно-активированная сортировка клеток и визуализационная проточная цитометрия для высокопроизводительной характеристики ядер. (A) Стратегия гатинга для сортировки с одним ядром FACS в пластину для опроса различных уровней плоидности. Затвор рассеяния на основе области прямого рассеяния по сравнению с областью бокового рассеяния, установленной для исключения мусора; ворота ядер на основе высоты Хёхста против области Хёхста, включающие несколько популяций ядер; синглетные ворота на основе набора Hoechst-Width и Hoechst-A для различения дублетов; гистограмма Hoechst-A позволяет визуализировать профиль плоидности ядер. (B) Репрезентативная количественная оценка цитометрии всех событий (слева) и одиночных (справа) событий с указанием диплоидных и тетраплоидных ядер. (C) Изображения Брайтфилда и Хёхста ядер 2n и 4n и их количественная оценка с использованием визуализационной цитометрии. Сокращения: FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; FSC-A = площадь прямого рассеяния; SSC-A = площадь бокового рассеяния; Hoechst-H = Высота Хёхста; Hoechst-A = Район Хёхст; Hoechst-W = Ширина Хёхста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Глубокая характеристика плоидности гепатоцитов с помощью snRNA-seq. (A) Скрипичные графики, показывающие количество генов, количество, процент обнаруженных митохондриальных генов и процент обнаруженных рибосомных генов. (B) UMAP демонстрирует типы клеток, обнаруженные с помощью snRNA-seq (слева), с количественной оценкой, выраженной в процентном соотношении ядер (справа). (C) UMAP иллюстрирует количество подсчетов и указывает на экспрессию генов, специфичных для гепатоцитов. Все ядра (верхний ряд), 2n ядра (средний ряд) и 4n ядра (нижний ряд). Сокращения: snRNA-seq = одноядерная РНК-seq; UMAP = равномерное многообразное приближение и проекция; миток. = митохондриальные гены; Рибос. = рибосомные гены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Контроль качества и анализ мультиомики (совместная РНК-сек и ATAC-seq) из замороженных, архивированных молодых печени. (А) Репрезентативные автоматические электрофоретические следы, полученные после мультиомного конвейера, показывающие молекулярно-массовый продукт после синтеза кДНК и ATAC. (B) Скрипичный график, демонстрирующий количество подсчетов для ATAC-seq, RNA-seq, процент митохондриальных генов и процент рибосомных генов до и после фильтрации. (C) UMAP показывает экспрессию генов из RNA-seq (слева), ATAC-seq (посередине) и совместных модальностей-RNA-seq и ATAC-seq (справа). (D) Различные типы клеток аннотируются разными цветами с экспрессией указанных генов, специфичных для гепатоцитов. (E) График признаков, показывающий кластерную экспрессию указанных генов в указанных типах клеток. Сокращения: ATAC-seq = анализ на транспозазно-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием; Mid Hep = среднезональные гепатоциты; Эндо = эндотелиальные клетки; PV Hep = перипортальные гепатоциты; Non-z Hep = незонированные гепатоциты; CV Hep = перицентральные гепатоциты; Kup & DC = Kupffer & dendritic cells; SC = звездчатые клетки, Neu = нейтрофилы; Хол = холангиоциты; миток. = митохондриальные гены; Рибос. = рибосомные гены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Реагент Запас 10 мл 15 мл 50 мл (A) Йодиксанол средний (IDM) 250 мМ Сахароза 1М 12.5 мл 150 мМ ККл 2М 3.75 мл 30 мМ MgCl2 1М 1,5 мл 60 мМ Tris буфер pH 8.0 1М 3 мл Сверхчистая вода без РНКазы 29.25 мл (B) 50 % IDM Йодиксанол 60% 12.5 мл ИДМ 2,5 мл (C) 29% IDM Йодиксанол 60% 7.25 мл ИДМ 7.75 мл (D) Среда выделения ядер-1 (NIM-1) 250 мМ Сахароза 1М 12.5 мл 25 мМ KCl 2М 0.625 мл 5 мМ MgCl2 1М 0.25 мл 10 мМ Tris буфер pH 8.0 1М 0,5 мл Сверхчистая вода без RNASE 36.125 мл (E) Среда выделения ядер-2 (NIM-2) Буфер NIM-1 9.99 мл Дитиотрейтол (DTT) 1 мМ 0.01 мл Таблетка ингибитора протеазы (без ЭДТА) 1 1 планшет f) Буфер гомогенизации (HB) Буфер NIM-2 9.697 мл Ингибитор рекомбинантной РНКАЗЫ 40 ЕД/мкл 0.1 мл Ингибитор РНКАЗы на белковой основе (SUPERase•IN) 20 ЕД/мкл 0.1 мл 0.1% Тритон-Х 10% 0.1 мл 3 мкг/мл Hoechst 33342 10 мг/мл 0.003 мл (G) Буфер хранения ядер (NSB) 166,5 мМ Сахароза 1М 1.665 мл 5 мМ MgCl2 1М 0.05 мл 10 мМ Трис pH 8.0 1М 0.1 мл Ингибитор рекомбинантной РНКАЗЫ 40 ЕД/мкл 0.1 мл Ингибитор РНКАЗЫ на белковой основе (SUPERase•IN) * 20 ЕД/мкл 0.1 мл Сверхчистая вода без РНКазы 8.085 мл * Опционально (только для сортировки FACS) Таблица 1: Рецепты растворов. (A) Получение среды йодиксанола (IDM); (B) 50% разведение раствора йодиксанола; (C) 29% разведение раствора йодиксанола. (D) Получение среды выделения ядер-1 (NIM-1). (E) Получение среды выделения ядер-2 (NIM-2). F) Подготовка буфера гомогенизации (HB). (G) Подготовка буфера хранения ядер (NSB).

Discussion

Рассечение клеточного состава печени одноклеточными или одноядерными РНК-сек обеспечивает более глубокое понимание развития и прогрессирования заболеваний печени 3,4,5,24. Изоляция одной клетки от печени отнимает много времени и требует протоколов, которые включают жесткую механическую или ферментативную диссоциацию 25,26,27. Широко признано, что каждая ткань требует систематической оценки для определения оптимального протокола диссоциации тканей, а также подходящего метода хранения для захвата хрупких типов клеток или ядер28. В зависимости от доступности ткани, заболевания, представляющего интерес, стадии развития или модельного организма, приготовление одноядерной суспензии для последующей обработки может быть более подходящей методологией, чем использование одноклеточных суспензий. Важно отметить, что в печени scRNA-seq и snRNA-seq показали высокую корреляцию между ядерной и цитоплазматической мРНК, предполагая, что оба подхода представляют комплементарную информацию 2,3,4,6,29.

Эта статья обеспечивает стандартизированную, надежную и воспроизводимую изоляцию одного ядра из замороженных, архивных образцов печени мышей и других видов, включая людей и макак. Этот метод может быть использован для мышей дикого типа, которых кормили чау и диетой с высоким содержанием жиров (HFD), а также для мышиных моделей фиброза печени с использованием как хорошо пластинчатых, так и капельных одноядерных геномных подходов6. Этот метод основан на протоколе, первоначально описанном для мозговой ткани Кришнасвами и др.30 с дополнительными модификациями, предназначенными для замороженной печенью. Оптимальная гомогенизация высвобождает большую часть ядер из ткани, не оказывая негативного влияния на целостность ядерной мембраны. Перепрыгивание, однако, может повредить хрупкие ядра и снизить их общее качество. Молодая и / или жировая печень обычно требует только 5 ударов с пестиком А и 10 ударов с пестиком В, в то время как старая и / или фиброзная печень может потребовать 15 ударов с пестиком В , но не более. Поэтому не рекомендуется выполнять больше штрихов сверх указанных здесь чисел. Перепрыгивание может негативно повлиять на качество одноядерной суспензии и увеличить количество окружающей РНК. Впоследствии это может привести к необходимости выполнения дополнительных этапов вычислительной фильтрации во время последующего анализа данных.

Протокол, представленный здесь, является универсальным и может быть адаптирован к различным заболеваниям печени у молодых (3 месяца) и старых (24 месяца) мышей. Поскольку мы обнаружили, что больший участок печени необходим для старых, HFD и фиброзных тканей, размер ткани, доступной для обработки, может представлять ограничение для некоторых пользователей с меньшим количеством исходного биологического материала. Тем не менее, градиентная очистка настоятельно рекомендуется для немедленной обработки образцов с помощью геномных анализов на основе капель. Если ядра необходимо отсортировать по 96-/384-луночным пластинам для хорошо обоснованных анализов, градиентная очистка может быть опущена. Мы рекомендуем пользователям по-прежнему выполнять градиентную очистку, если есть достаточно образца ткани для получения рекомендуемой концентрации ядер для сортировки FACS (т. Е. ~ 1 × 105 ядер / мл).

Печень характеризуется полиплоидной природой гепатоцитов9, но роль плоидности гепатоцитов в нормальной физиологии и заболевании пока не ясна. Существует все больше доказательств, указывающих на то, что плоидность обеспечивает геномную изменчивость31, и хорошо известно, что плоидия увеличивается с возрастом 32,33 года. Обогащение мононуклеированных тетраплоидных гепатоцитов, однако, также клинически связано с плохим прогнозом при гепатоцеллюлярной карциноме человека (ГЦК)34. Аналогичным образом, изменения в уровнях плоидности гепатоцитов связаны со связанными со старением хроническими заболеваниями печени, такими как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП)35,36,37. Плоидия — это условие обладания более чем двумя копиями генома, которые могут быть исследованы путем окрашивания содержимого генома красителем ДНК, таким как Hoechst38. Краситель Hoechst, который добавляется в HB перед извлечением, маркирует все ядра во время протокола изоляции. Это позволяет проводить различие между диплоидными и полиплоидными ядрами на основе их содержания ДНК при возбуждении ультрафиолетовым (350 нм) или фиолетовым (450 нм) лазером на приборе проточной цитометрии. С помощью продемонстрированной стратегии 2n, 4n, 8n и более высокие уровни плоидии гепатоцитов могут быть исследованы в замороженной, архивированной печени, чтобы лучше понять роль клеточной гетерогенности в функциитканей 1 (рисунок 3A). Кроме того, ядерная морфология, включая размер и объем, может быть количественно определена с помощью визуализационной проточной цитометрии для корреляции изменений размера ядра с изменениями общего числа подсчетов или количества генов в зависимости от уровня плоидности (рисунок 3B, C).

Мультимодальное измерение омики дает возможность исследовать несколько слоев геномной организации одновременно. Совместный мультиомический подход РНК + ATAC позволяет исследовать регуляторы восходящего потока и нисходящие метаболические гены, обеспечивая комплексный подход к изучению транскрипционных сетей и архитектуры хроматина, связанной с функцией печени при одноклеточном разрешении. Кроме того, благодаря достижениям в вычислительных методах, которые могут учитывать разреженность данных и снижение затрат на секвенирование, одноклеточная мультиомика является пионером в оценке нескольких модальностей из одной и той же ячейки. Этот протокол изоляции одного ядра совместим с индивидуальной и совместной оценкой экспрессии и наборов данных хроматина. Мы использовали стандартные конвейеры, установленные Stuart et al.23 (пакет Signac), чтобы проиллюстрировать качество данных, в то время как несколько доступных и альтернативных вычислительных методов могут быть легко приняты для последующего анализа 23,39,40,41.

В целом, одноядерная мультиомика позволяет исследовать биоархивные, FF мышиные, человеческие и нечеловеческие ткани печени приматов с использованием очень небольшого количества исходного образца материала путем реализации протокола извлечения ядра, представленного здесь. Этот бесценный инструмент позволит биологам печени исследовать как экспрессию генов, так и доступность хроматина в контексте различных патологий печени. Кроме того, различные уровни плоидии гепатоцитов и результирующая корректировка экспрессии генов в зависимости от их расположения в дольке печени могут выявить их роль в патологиях печени. Поэтому мы ожидаем, что исследование клеточной гетерогенности предоставит новые возможности для развития прецизионной медицины и целенаправленных вмешательств против таких заболеваний, как ГЦК и НАЖБП.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Пионерским кампусом Гельмгольца (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) и Институтом вычислительной биологии (C.T.-L.). Это исследование также было поддержано AMED под номером гранта JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Мы благодарим Core Genomics в HMGU (I. de la Rosa) и Bioinformatics (T. Walzthoeni) поддержку, в частности Ксавье Пастора за обучение и руководство. Мы благодарим А. Фойхтингера, У. Бухгольца, Д. Буше и всех других сотрудников основного центра патологии и анализа тканей HMGU за их техническую и научную поддержку, а также Й. Цорна, Р. Эрделена, Д. Вюрцингера, сотрудников E-Streifen, а также основного объекта Laboratory Animal Services за их постоянную научную поддержку и обсуждение. Мы благодарны компании Core Facility Cell Analysis в TranslaTUM (Р. Мишра) и Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Мы благодарим д-ра I Делиянниса за его техническую поддержку. Д-р М. Хартман, д-р А. Шредер и г-жа А. Барден (пионерский кампус Гельмгольца) имели основополагающее значение для своей юридической, управленческой и административной поддержки.

Materials

10% Tween 20 – 5 mL Bio-Rad 1662404
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA
Adhesive PCR film Thermo Fisher Scientific AB0558
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196
Cell Sorter For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428000619 Use chilled at 4 °C
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics 1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X Genomics 1000127
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions 10X Genomics 1000230
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions 10X Genomics 1000269
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions 10X Genomics 1000285
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 11873580001
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution Sigma Aldrich 646563 Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration.
DNA AWAY Surface Decontaminant Thermo Fisher Scientific 10223471 Wipe surfaces and pipettes before start of experiment
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 16628742
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 16638742
Elution Buffer (EB) – 250 mL Qiagen 19086
Eppendorf ThermoMixer C Thermo Fisher Scientific 13527550
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock Thermo Fisher Scientific 13518470
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade – 100 mL  Thermo Fisher Scientific 10517694
Filters 50 µm, sterile   SYSMEX PARTEC – CELLTRICS 04-004-2327 Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) – 1 L Ricca Chemical Company 3290-32
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white Bio-Rad HSP3905
Herenz Heinz ABS Forceps Thermo Fisher Scientific 1131884
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Invitrogen H3570 Light-sensitive
Imaging Flow Cytometer For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream
Invitrogen TE Buffer – 100 mL Thermo Fisher Scientific 11568846
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL Thermo Fisher Scientific AM9640G
MgCl2 (1 M), 100 mL Thermo Fisher Scientific AM9530G
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips Thermo Fisher Scientific 10209104
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips Thermo Fisher Scientific 10733087
Mörser 2 mL DOUNCE Wagner & Munz GmbH 9651632 RNase zap and rinse with MillQ before use
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 Benchmark Scientific C1012 Or any other strip and tube mini centrifuge
Neubauer Hemocytometer OMNILAB  LABORZENTRUM 5435293 Visualize and count nuclei under microscope
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Thermo Fisher Scientific AM9937
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma Aldrich D1556
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O Mettler Toledo 30389218
Pistill "A" 2 mL Wagner & Munz GmbH  9651621 RNase zap and rinse with MillQ before use
Pistill "B" 2 mL Wagner & Munz GmbH 9651627 RNase zap and rinse with MillQ before use
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube Thermo Fisher Scientific 10579691
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm Thermo Fisher Scientific 10634141
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes Thermo Fisher Scientific 10100151
Protector RNase inhibitor – 2,000 U Sigma Aldrich 3335399001 Keep in -20 °C until use
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) Thermo Fisher Scientific AM2696 Keep in -20 °C until use
Recombinant RNase Inhibitor Clontech Takara 2313B Keep in -20 °C until use
RNAse free microfuge tubes – 0.5 mL Thermo Fisher Scientific AM12450
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780 Wipe surfaces and pipettes before start of experiment
SPRIselect – 60 mL Beckman Coulter B23318 Aliquot and store in 4 °C
Sucrose, 500 g Sigma Aldrich S0389-500G Make a 1 M stock solution
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels Thermo Fisher Scientific 11798343
Tris-HCI (1M), pH 8.0 Invitrogen 15568025
Triton X-100, 98%, 100 mL Thermo Fisher Scientific 10671652 Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light.
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 11538886
Vortex- Mixer VWR 444-1372 Or any other type of vortex
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now. Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).
  2. Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).
  3. Ramachandran, P., et al. Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level. Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).
  4. Andrews, T. S., et al. Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity. Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).
  5. Xiong, X., et al. Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis. Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).
  6. Richter, M. L., et al. Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy. Nature Communications. 12 (1), 4264 (2021).
  7. Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration. Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).
  8. Chen, F., et al. Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).
  9. Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy in liver development, homeostasis and disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).
  10. Lengefeld, J., et al. Cell size is a determinant of stem cell potential during aging. Science Advances. 7 (46), 0271 (2021).
  11. Lanz, M. C., et al. Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence. Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).
  12. Kim, J. Y., et al. PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis. Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).
  13. Padovan-Merhar, O., et al. Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms. Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).
  14. Miettinen, T. P., et al. Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size. Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).
  15. Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells. Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).
  16. Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. . Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition). , (2018).
  17. Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2019)
  18. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide (2021)
  19. MacParland, S. A., et al. Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations. Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).
  20. Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism. Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).
  21. Schmidt, D., et al. Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding. Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).
  22. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  23. Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. Single-cell chromatin state analysis with Signac. Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).
  24. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver. Science. 371 (6531), 839-846 (2021).
  25. Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism. Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).
  26. Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
  27. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  29. Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).
  30. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  31. Duncan, A. W., et al. Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation. Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).
  32. Kreutz, C., et al. Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis. Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).
  33. Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. Hallmarks of aging in the liver. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).
  34. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. 69 (2), 355-364 (2019).
  35. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  36. Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age. Liver. 9 (2), 93-99 (1989).
  37. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).
  38. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  39. Granja, J. M., et al. ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis. Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).
  40. Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. MUON: Multimodal omics analysis framework. Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).
  41. Velten, B., et al. Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO. Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).

Tags

Nuclei IsolationSingle-cell MultiomicsDensity Gradient CentrifugationIodixanolCell StrainerBio-archived Human Liver SamplesMouse ModelNon-human Primate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Strzelecki, M., Yin, K., Talavera-López, C., Martinez-Jimenez, C. P. Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics. J. Vis. Exp. (190), e64792, doi:10.3791/64792 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image