Agrobacterium tumefaciens - 좁은 잎 질경이의 매개 유전자 변형

알림: 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7 및 6.1-6.3단계는 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드를 사용하여 무균 상태에서 수행해야 합니다. 1. 변형을 위한 식물 재료 번식 시중에서 판매되는 야생형(WT) 질경이 란쾡 이 종자( 재료 표 참조)를 원하는 식물 수에 따라 최대 5mL 라인까지 50mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.알림: 또는 적은 수의 종자가 필요할 때 2mL 미세 원심분리기 튜브를 사용할 수 있지만 종자가 너무 많으면 멸균 효율이 떨어질 수 있으므로 0.1mL 이하의 부피로 채워야 합니다. 씨앗을 75 % 에탄올에 60 초 동안 담그십시오. 에탄올을 버린 다음 씨앗을 20 % 차아 염소산 나트륨 (20 % NaClO, 80 % 멸균 수)에 40 분 동안 담그고 튜브를 부드럽게 뒤집어 모든 씨앗이 용액과 접촉하도록합니다.알림: 차아염소산나트륨 용액은 최적의 결과를 위해 새로 만들어야 합니다. 층류 후드 아래에서 차아염소산나트륨 용액을 버린 다음 씨앗을 증류수(5회)로 씻습니다. 최종 헹굼 후 씨앗에 소량의 물을 추가하면 식물이 접시로 이동하는 데 도움이 될 수 있습니다. 멸균된 집게를 사용하여 씨앗을 고체 MS 배지가 있는 미리 준비된 95mm x 100mm 페트리 접시에 옮깁니다(표 1). 발아 된 묘목의 과밀을 방지하기 위해 각 씨앗 사이에 약 1cm의 간격을 두고 접시 표면에 씨앗을 고르게 뿌립니다(그림 1A). 오염을 방지하기 위해 플레이트를 두 층의 파라핀 필름으로 밀봉한 다음 실온(22°C, 50μmol m-2s-1, 12시간)에서 차가운 백색 성장 조명(재료 표 참조) 아래에서 배양합니다. 씨앗은 일반적으로 5-6일 이내에 발아합니다. 묘목이 발아하고 옮길 수 있을 만큼 충분히 커지면(그림 1B), 일반적으로 발아 후 2-3일이 지나면 멸균된 집게를 사용하여 묘목을 50-100mL의 MS 배지와 함께 멸균 상자에 옮깁니다(표 1). 이상적으로는 최고 품질의 뿌리를 얻기 위해 상자 당 5 개의 묘목 만 심습니다. 수술용 테이프로 상자를 밀봉한 다음 1.6단계에서 언급한 것과 동일한 조건에서 식물이 서늘한 흰색 성장 조명 아래에서 자랄 수 있도록 합니다( 재료 표 참조). 식물은 약 3-4 주 안에 또는 주 뿌리의 길이가 약 2cm 자라고 측면 뿌리가 흰색으로 보일 때 변형 될 준비가되어 있어야합니다.참고: 중간 준비 레시피와 비타민 스톡은 표 1 과 표 2에 포함되어 있습니다. 2. 플라스미드 구축 및 대장균 형질전환 참고: 정확한 플라스미드 구성 절차는 관심 유전자에 따라 다릅니다. 이 절차에서, 제한 효소 HindIII 및 SalII를 사용하여 표준 클로닝 절차20을 사용하여 GUS와 함께 이진 플라스미드 pBI101 (재료 표 참조)에 1.5kb AtPP2 프로모터를 삽입했습니다. AtPP2(체관 단백질 2)는 체관21에서 특이적으로 발현되는 유전자입니다. 애기장대에서 프라이머 쌍 5′-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3′(정방향) 및 5′-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGTATTTATTTG-3′(역방향)을 사용하여 프로모터를 복제합니다. 그림 2는 AtPP2:GUS 삽입물이 있는 이진 플라스미드 벡터의 다이어그램을 보여줍니다. 플라스미드 구축 후, 플라스미드를 열 충격 방법22를 사용하여 DH5a 대장균(재료 표 참조)을 적격 세포로 형질전환시킨 다음, 진탕(150 rpm)하면서 37°C에서 1.5시간 동안 인큐베이션한다. 각 형질전환 배양액 150μL를 LB 한천 배지 플레이트(표 1)에 적절한 선택(이 프로토콜에 사용된 균주에 대한 50mg/L 카나마이신, 재료 표 참조)한 다음 플레이트를 37°C에서 16-24시간 동안 배양합니다.참고: 이 연구에 사용된 박테리아 균주는 A. tumefaciens GV3101입니다. 다음으로, 콜로니 PCR을 사용하여 콜로니에서 양성 재조합체를 스크리닝한다23.참고: 이 프로토콜에서는 표적 유전자를 증폭하기 위해 다음 프라이머를 사용했습니다. 5′-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3′(정방향) 및 5′-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3′(후진).95°C에서 3분의 사이클링 조건으로 열순환기( 재료 표 참조)에서 반응을 실행한 후 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 2분, 72°C에서 최종 10분 신장 단계의 35회 사이클을 수행합니다. 6mL의 LB 액체배지(표 1)에 양성 콜로니를 적절한 항생제(50mg/L 카나마이신)로 접종하고 37°C에서 하룻밤 동안 200-250rpm으로 성장시킵니다. 하룻밤 성장 후, 표준 절차24를 사용하여 박테리아로부터 플라스미드를 추출한다. 3. A. 플라 스미드를 이용한 형질전환 플라스미드 추출 후, 전기천공법을 사용하여 변형된 플라스미드를 원하는 적격 세포 균주로 변형시킵니다. 본 과정에서는 A. tumefaciens 균주 GV3101을 사용하였다. 전기천공 기법에 대한 표준화된 방법을 따른다25. 전기천공 후, 컴피턴트 세포를 LB 브로스 1mL에 재현탁한 다음, 28°C에서 100rpm으로 2-4시간 동안 인큐베이션한다. 실온(22°C)의 탁상용 미세원심분리기(재료 표 참조)에서 6,800 x g에서 3분 동안 원심분리를 통해 세포를 수집한 다음 적절한 선별제(이 프로토콜에 사용된 플라스미드의 경우 50mg/L 카나마이신)와 함께 LB 한천 플레이트에 50-100μL를 뿌립니다. 세포를 28°C에서 2일 동안 배양한 후, 콜로니 PCR을 사용하여 관심 유전자를 함유하는 양성 콜로니를 확인한다. 이 프로토콜에서는 2.4 단계에서 언급 된 프라이머 및 조건을 사용하십시오. 다음으로, 양성 콜로니를 사용하여 LB 한천 배지 + 선택으로 스톡 플레이트를 줄무늬로 만듭니다. 플레이트는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. 또는 장기 보관을 위해 적절한 선택으로 소량의 LB로 양성 콜로니를 접종하십시오. 접종된 배양물을 28°C에서 200rpm으로 밤새 흔들어 준 다음 최대 10년 동안 -80°C에서 보관할 수 있는 글리세롤 스톡(박테리아와 글리세롤의 50:50 혼합에서 50% w/v 글리세롤)을 준비합니다. 4. A. tumefaciens 준비 적절한 선택제와 함께 준비된 95mm x 100mm 고체 LB 플레이트에 원하는 플라스미드를 포함하는 줄무늬 A. tumefaciens . 이 프로토콜에서는 플라스미드 삽입물 AtPP2:GUS 가 있는 박테리아 균주 GV3101을 사용했으며 선택을 위해 50mg/L 카나마이신을 추가했습니다. 플레이트를 파라핀 필름으로 밀봉한 다음 28°C에서 최대 48시간 동안 또는 박테리아가 선택할 수 있을 만큼 커질 때까지 배양합니다. 형질전환 2일 전에 피펫 팁을 사용하여 박테리아 집락을 선택하고 적절한 선택으로 6mL의 액체 LB가 들어 있는 15mL 둥근 바닥 튜브에 접종합니다. OD600 이 0.6-0.7에 도달할 때까지 28°C 탁상용 셰이커에서 밤새 200rpm으로 흔들어줍니다.알림: 플레이트와 6mL 박테리아 접종물은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. 박테리아가 올바른 OD600에 도달하면 피펫을 사용하여 A. tumefaciens 를 선별제와 함께 100mL의 액체 LB가 들어 있는 멸균 플라스크에 옮깁니다. 일반적으로 100mLLB당 200μL의 박테리아가 번식에 적합합니다. OD600 이 0.6-0.7에 도달할 때까지 28°C에서 밤새 200rpm으로 흔들어 줍니다. 박테리아를 50mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮기고 탁상용 원심분리기에서 실온(22°C)에서 10분 동안 2,200 x g 로 원심분리하여 박테리아를 수집합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다. 박테리아 펠릿을 피펫팅으로 실온(22°C) 액체 현탁액 용액(SS) 5mL(표 1)에 재현탁한 다음 최대 50mL의 SS를 추가하고 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 박테리아는 이제 변형될 준비가 되었습니다.알림: 액체 SS는 변형 후 1주일 이내에 신선하게 준비해야 합니다.주의 : A. tumefaciens 와 접촉하는 모든 물질은 생물학적 위험 쓰레기통에 버려야 합니다. 박테리아 배양에서 남은 액체는 차아염소산나트륨(표백제)으로 20% 이상의 농도로 멸균할 수 있습니다. 5. 질경이 뿌리의 변형 식물이 형질전환을 위한 이상적인 단계(묘목은 3주령)에 도달하면(그림 1C) 멸균 집게와 가위를 사용하여 식물의 나머지 부분과 뿌리를 분리합니다(그림 3A). 잎과 줄기 재료를 버리십시오. 절단 직후, 멸균 집게를 사용하여 멸균 된 물이 들어있는 멸균 상자에 뿌리 조각을 옮깁니다. 이 단계를 통해 모든 조직이 수집되는 동안 뿌리가 수분을 유지할 수 있습니다. 모든 뿌리가 절단되면 A. tumefaciens/SS 현탁액을 멸균된 150mm x 15mm 일회용 페트리 접시에 붓습니다. 뿌리를 A. tumefaciens 배양액으로 옮기고 최소 20분 동안 접종합니다(그림 3B). 부화하는 동안 날카로운 칼날이 달린 멸균 메스를 사용하여 뿌리를 1cm 조각으로 자르고 1 차 뿌리를 측면 뿌리에서 분리합니다. 박테리아가 식물을 감염시킬 수 있도록 뿌리 표면을 얇고 얕게 자릅니다.참고: 많은 수의 식물을 다루는 경우 뿌리 조각을 일괄적으로 박테리아 배양에 옮겨 접종하는 동안 모든 뿌리가 잠기도록 합니다. 배양 후 멸균 겸자를 사용하여 뿌리 조각을 멸균 종이 타월로 옮겨 과도한 박테리아를 제거합니다. 탈수를 일으키고 뿌리 조직을 손상시킬 수 있으므로 60초 이상 뿌리를 건조시키지 마십시오. 이상적으로는 10-15 개의 뿌리를 동시에 건조시킬 수 있습니다 (그림 3C). 건조된 뿌리를 고체 공동 배양 배지(표 1)를 사용하여 준비된 95mm x 15mm 페트리 접시에 옮기고, 뿌리의 크기에 따라 플레이트당 약 10-20개의 뿌리를 만듭니다(그림 3D). 투명 플라스틱 필름의 두 층으로 플레이트를 밀봉 한 다음 알루미늄 호일로 덮습니다. 실온(22°C)에서 3일 동안 배양한다. 이 단계는 박테리아가 항생제 선택 없이 뿌리를 감염시킬 수 있는 시간을 제공합니다(그림 3E). 6. 선택 및 전체 식물 재생 공동 배양 배지에서 배양한 후 뿌리 조각을 Timentin(500mg/L, 재료 표 참조)과 함께 고체 싹 유도 배지(SIM)(표 1)와 함께 준비된 95mm x 15mm 페트리 접시에 옮기고 적절한 항생제를 선택합니다. 이 프로토콜에서는 카나마이신(100mg/L)을 사용했습니다.알림: 뿌리의 바닥은 배지와 완전히 접촉해야 합니다. 배지 표면에 닿지 않는 뿌리는 너무 길기 때문에 조직이 선택을 벗어나지 않도록 잘라야 합니다. 두 겹의 투명 플라스틱 필름으로 판을 밀봉한 다음 1개월 동안(적절한 조건은 1.6단계 참조) 또는 새싹이 나오기 시작할 때까지 자라는 빛 아래에서 자랍니다.참고: 일반적으로 싹 이니셜은 성장 2주 후에 관찰할 수 있으며 싹은 일반적으로 1개월 후에 볼 수 있습니다. 묘목의 길이가 1.5-2.0cm일 때(그림 1D), 단단한 뿌리 유도 매체가 있는 준비된 멸균 상자에 옮깁니다(표 1). 뿌리가 형성 될 때까지 몇 주 동안 성장 조명 아래에서 식물을 재배하십시오 (조건은 1.6 단계 참조). 뿌리는 일반적으로 1주일 후에 처음 볼 수 있습니다.알림: 뿌리 시스템이 더 큰 식물은 토양에서 생존율이 더 높은 경향이 있으므로 토양으로 이동하기 전에 뿌리가 몇 주 동안 자라도록 하는 것이 좋습니다. 7. 토양 이송 뿌리 시스템이 옮길 수 있을 만큼 커지면(그림 1E), 일반적으로 성장 1개월 후, 식물을 미리 습윤된 다목적 토양(BM7)이 들어 있는 정사각형 화분에 3.5로 옮깁니다. 이 프로토콜에서, BM7 껍질 믹스를 사용하였다 ( 재료 표 참조).뿌리에 달라붙는 배지는 물로 부드럽게 씻어 제거합니다.참고: 식물은 600W 고나트륨 압력 조명(재료 표 참조)을 사용하여 800 내지 1400 μmol 광자 m-2 s-2의 온실에서 성숙할 수 있거나, 실온(22 °C)의 성장 챔버에서 50 μmol m-2 s-1, 12 h 일의 차가운 백색광을 사용하여 성장할 수 있습니다. 플라스틱 화분 덮개로 식물을 덮은 다음 투명한 비닐 봉지로 덮으십시오. 이 단계를 통해 식물은 토양에 적응할 때 습한 환경에 머물 수 있습니다. 약 3-5일 후 비닐봉지를 제거한 후 뚜껑을 천천히 제거하여 외부 환경에 적응합니다.알림: 연중 시기와 식물이 옮겨지는 환경에 따라 식물이 적응해야 하는 시간이 다를 수 있습니다. 매일 식물을 확인하고 필요에 따라 화분에 물을 추가하는 것이 좋습니다. 식물에 정기적으로 물을주고 필요에 따라 비료를 추가하십시오. 식물은 또한 추가 성장을 위해 더 큰 화분으로 옮길 수 있습니다 (그림 1F). 8. β-글루쿠로니다아제(GUS) 조직화학적 염색 공개된 프로토콜15에 따라 β-글루쿠로니다아제(GUS) 염색 용액을 준비합니다. 싹의 이니셜 길이가 약 0.5-1cm이면 완전히 확장된 어린 잎의 작은 끝(일반적으로 길이가 <5mm이면 충분함)을 제거하고 즉시 1.5 또는 2mL 미세 원심분리기 튜브에 있는 0.5-1mL의 GUS 염색 용액으로 옮깁니다. 용액은 식물 조직을 완전히 덮어야합니다. 열린 튜브를 진공 데시케이터에 넣고 20-25kPa에서 5-10분 동안 진공 청소기로 청소합니다. 진공 절차 중에 용액에 작은 기포가 보일 수 있어야합니다. 이렇게하면 용액이 식물의 세포에 들어갈 수 있습니다. 공기가 진공 건조기로 다시 여과되도록 합니다. 튜브를 닫고 37°C에서 하룻밤(12시간) 또는 파란색이 보일 때까지 배양합니다.참고: 이 연구에서 GUS 활성은 체관부에 국한되었으며, 이는 양성으로 형질전환된 식물에서 청색 염색이 체관 조직에서만 볼 수 있어야 함을 의미합니다. 이식유전자가 없는 식물은 염색을 경험하지 않습니다(그림 4). 얼룩을 더 잘 시각화하려면 식물을 100 % 에탄올로 옮겨 엽록소를 제거하십시오. 엽록소 제거 공정의 효율을 높이려면 튜브를 60°C에서 10분 동안 배양합니다.알림: 염색되는 잎의 크기에 따라 모든 엽록소가 제거되기 전에 에탄올을 여러 번 교체해야 할 수도 있습니다.