In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen
Summary
In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.
Abstract
Het proces van myelinisatie is essentieel om een snelle en voldoende signaaltransductie in het zenuwstelsel mogelijk te maken. In het perifere zenuwstelsel gaan neuronen en Schwann-cellen een complexe interactie aan om de myelinisatie van axonen te beheersen. Verstoringen van deze interactie en afbraak van de myelineschede zijn kenmerken van inflammatoire neuropathieën en komen secundair voor bij neurodegeneratieve aandoeningen. Hier presenteren we een cocultuurmodel van dorsale wortelganglionexplantaten en Schwann-cellen, dat een robuuste myelinisatie van perifere axonen ontwikkelt om het proces van myelinisatie in het perifere zenuwstelsel te onderzoeken, axon-Schwann-celinteracties te bestuderen en de potentiële effecten van therapeutische middelen op elk celtype afzonderlijk te evalueren. Methodologisch werden dorsale wortelganglions van embryonale ratten (E13.5) geoogst, gedissocieerd van hun omringende weefsel en gedurende 3 dagen als volledige explantaten gekweekt. Schwann-cellen werden geïsoleerd van 3 weken oude volwassen ratten en ischiaszenuwen werden enzymatisch verteerd. De resulterende Schwann-cellen werden gezuiverd door magnetisch geactiveerde celsortering en gekweekt onder neureguline- en forskoline-verrijkte omstandigheden. Na 3 dagen dorsale wortel ganglion explantatiecultuur werden 30.000 Schwann-cellen toegevoegd aan één dorsale wortelganglionexplant in een medium dat ascorbinezuur bevat. De eerste tekenen van myelinisatie werden gedetecteerd op dag 10 van cocultuur, door verspreide signalen voor myeline basisch eiwit in immunocytochemische kleuring. Vanaf dag 14 werden myelineschedes gevormd en verspreid langs de axonen. Myelinisatie kan worden gekwantificeerd door myeline basiseiwitkleuring als een verhouding van het myelinisatiegebied en het axongebied, om rekening te houden met de verschillen in axonale dichtheid. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om verschillende aspecten van perifere myelinisatie in vitro te bestuderen, wat cruciaal is voor het begrijpen van de pathologie van en mogelijke behandelingsmogelijkheden voor demyelinisatie en neurodegeneratie bij inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten van het perifere zenuwstelsel.
Introduction
In het perifere zenuwstelsel (PNS) wordt snelle informatietransductie gemedieerd door met myeline omwikkelde axonen. De myelinisatie van axonen is essentieel om de snelle voortplanting van elektrische impulsen mogelijk te maken, omdat de geleidingssnelheid van de zenuwvezels correleert met de axondiameter en myelinedikte1. Sensorische signalering van de periferie naar het centrale zenuwstelsel (CZS) is afhankelijk van de activering van sensorische neuronen van de eerste orde die zich bevinden in vergrotingen van de dorsale wortel, genaamd dorsale wortelganglia (DRG). Voor de vorming en het onderhoud van myeline is continue communicatie tussen axonen en Schwann-cellen, de myeliniserende Glia-cellen in de PNS, verplicht2.
Veel ziekten van de PNS verstoren de transductie van informatie door primaire axonale of demyeliniserende schade, wat resulteert in hypesthesie of dysesthesie. Sensorische neuronen van de eerste orde hebben het vermogen om tot op zekere hoogte te regenereren na neuronale schade, door een complexe interactie tussen het neuron en de omliggende Schwann-cellen3. In dit geval kunnen Schwann-cellen cellulaire herprogrammering ondergaan om zowel axonaal als myeline-puin te verwijderen en axonale regeneratie te bevorderen, wat resulteert in remyelinisatie4. Het begrijpen van de mechanismen van myelinisatie in gezondheid en ziekte is belangrijk om mogelijke behandelingsopties te vinden voor demyeliniserende aandoeningen van de PNS. Myeline kan ook worden beschadigd door acuut neurotrauma en benaderingen om myelinisatie te bevorderen om functioneel herstel na perifeer zenuwletsel te bevorderen, worden onderzocht5.
Onze kennis van perifere myelinisatie heeft grotendeels geprofiteerd van myeliniserende coculturen van Schwann-cellen en sensorische neuronen. Sinds de eerste benaderingen werden toegepast 6,7,8, is myelinisatie intensief bestudeerd met behulp van verschillende cocultuursystemen9,10,11. Hier bieden we een snel en gemakkelijk protocol voor robuuste in vitro myelinisatie van dorsale wortelganglion axonen. Het protocol voor Schwann-celpreparatie is gebaseerd op het protocol van Andersen et al.12, eerder gepubliceerd in Pitarokoili et al.13. We gebruiken Schwann-cellen afkomstig van juveniele ratten en embryonale DRG-explantculturen voor de cocultuur, waarbij myelinisatie optreedt rond dag 14. Het doel van de methode is om een systeem te bieden om de vorming van myeline als gevolg van directe axon-Schwann-celinteractie te onderzoeken en om modulatoren van PNS-myelinisatie te bestuderen. In vergelijking met gedissocieerde neuronale celculturen zijn DRG-explantaten anatomisch meer bewaard gebleven en vormen ze lange axonale processen. Kwantificering van het gemyeliniseerde axongebied biedt een voldoende uitlezing voor myelinisatie in de cocultuur. De methode is een waardevol hulpmiddel om therapeutische verbindingen te screenen op hun potentiële effect op PNS-myelinisatie en kan ook worden gebruikt naast in vivo studies in diermodellen14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een snel en gemakkelijk protocol voor het genereren van in vitro myelinisatie door twee afzonderlijke celtypeculturen, Schwann-cellen en dorsale wortelganglionexplantaten, samen te voegen.
Een cruciale stap van het protocol is de teelt van DRG-explantaten, vooral in de eerste dagen van de teelt. DRG zijn zeer kwetsbaar voordat een sterk axonaal netwerk wordt gebouwd en moeten zeer voorzichtig worden behandeld, bijvoorbeeld wanneer ze uit de incubator worden gehaald…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Prof. Dr. Ralf Gold en PD Dr. Gisa Ellrichmann voor hun advies en steun.
Materials
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C. Schwann cells-axon interaction in myelination. Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
