الماوس في الجسم الحي المشيمة المستهدفة كريسبر التلاعب
Summary
نصف هنا طريقة محددة زمنيا للتعامل بفعالية مع المسارات التنموية الحرجة في مشيمة الفأر في الجسم الحي. يتم إجراء ذلك من خلال الحقن والتثقيب الكهربائي لبلازميدات كريسبر في مشيمة السدود الحامل في اليوم الجنيني 12.5.
Abstract
المشيمة هي عضو أساسي ينظم ويحافظ على نمو الثدييات في الرحم. المشيمة مسؤولة عن نقل العناصر الغذائية والفضلات بين الأم والجنين وإنتاج وتوصيل عوامل النمو والهرمونات. تعد التلاعب الجيني المشيمي في الفئران أمرا بالغ الأهمية لفهم الدور المحدد للمشيمة في تطور ما قبل الولادة. الفئران المعدلة وراثيا المعبرة عن المشيمة لها فعالية متفاوتة ، ويمكن أن تكون الطرق الأخرى لمعالجة الجينات المشيمة بدائل مفيدة. تصف هذه الورقة تقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة الجينات كريسبر ، والتي يمكن استخدامها لتعديل التعبير عن الجينات المستهدفة. باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، تخضع السدود الحامل لبضع البطن في اليوم الجنيني 12.5 (E12.5) ، ويتم تسليم بلازميد كريسبر بواسطة ماصة زجاجية دقيقة إلى المشيمة الفردية. يتم إلكتروبيد البلازميد على الفور بعد كل حقنة. بعد تعافي السد، يمكن أن تستمر المشيمة والأجنة في النمو حتى التقييم في وقت لاحق. يمكن أن يحدد تقييم المشيمة والنسل بعد استخدام هذه التقنية دور وظيفة المشيمة المحددة زمنيا في التنمية. سيسمح هذا النوع من التلاعب بفهم أفضل لكيفية تأثير علم الوراثة المشيمة ووظيفتها على نمو الجنين وتطوره في سياقات مرضية متعددة.
Introduction
المشيمة هي عضو أساسي يشارك في نمو الجنين. يتمثل الدور الرئيسي للمشيمة في توفير العوامل الأساسية وتنظيم نقل العناصر الغذائية والفضلات من وإلى الجنين. تتكون مشيمة الثدييات من أنسجة الجنين والأم ، والتي تشكل واجهة الجنين والأم ، وبالتالي ، فإن الوراثة لكل من الأم والجنين تؤثر على الوظيفة1. يمكن أن تؤدي التشوهات الوراثية أو ضعف وظيفة المشيمة إلى تغيير نمو الجنين بشكل كبير. أظهرت الأعمال السابقة أن علم الوراثة المشيمية وتطورها يرتبطان بالتطور المتغير لأنظمة أعضاء معينة في الجنين. على وجه الخصوص ، ترتبط التشوهات في المشيمة بالتغيرات في دماغ الجنين والقلب ونظام الأوعية الدموية2،3،4،5.
يلعب نقل الهرمونات وعوامل النمو والجزيئات الأخرى من المشيمة إلى الجنين دورا رئيسيا في نمو الجنين6. لقد ثبت أن تغيير إنتاج المشيمة لجزيئات معينة يمكن أن يغير النمو العصبي. يمكن أن يزيد التهاب الأم من إنتاج السيروتونين عن طريق تغيير التعبير الجيني الأيضي للتريبتوفان (TRP) في المشيمة ، مما يؤدي لاحقا إلى تراكم السيروتونين في دماغ الجنين7. وقد وجدت دراسات أخرى تشوهات المشيمة جنبا إلى جنب مع عيوب القلب. يعتقد أن التشوهات في المشيمة تساهم في عيوب القلب الخلقية ، وهو أكثر العيوب الخلقية شيوعا لدى البشر8. حددت دراسة حديثة العديد من الجينات التي لها مسارات خلوية مماثلة في كل من المشيمة والقلب. إذا تعطلت ، يمكن أن تسبب هذه المسارات عيوبا في كلا الجهازين9. قد تؤدي العيوب في المشيمة إلى تفاقم عيوب القلب الخلقية. يعد دور علم الوراثة المشيمة ووظيفتها في تطوير نظام أعضاء الجنين المحدد مجالا ناشئا للدراسة.
الفئران لديها المشيمة الدموية وغيرها من ميزات المشيمة البشرية ، مما يجعلها نماذج مفيدة للغاية لدراسة الأمراض البشرية1. على الرغم من أهمية المشيمة ، يوجد حاليا نقص في التلاعب الجيني المستهدف في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يوجد حاليا المزيد من الخيارات المتاحة للضربة القاضية أو الضربات القاضية أكثر من الإفراط في التعبير أو التلاعب باكتساب الوظيفة في المشيمة10. هناك العديد من خطوط التعبير عن الكري المعدلة وراثيا للتلاعب الخاص بالمشيمة ، كل منها في سلالات الأرومة الغاذية المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. وتشمل هذه Cyp19-Cre و Ada / Tpbpa-Cre و PDGFRα-CreER و Gcm1-Cre 11،12،13،14. في حين أن جينات التحوير Cre هذه فعالة ، فقد لا تكون قادرة على التلاعب ببعض الجينات في نقاط زمنية محددة. هناك طريقة أخرى شائعة الاستخدام إما للتعبير الجيني عن الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير عن التعبير الوراثي المشيمي وهي إدخال ناقلات الفيروسات العدسية في مزرعة الكيسة الأريمية ، مما يؤدي إلى التلاعب الجيني الخاص بالأرومة الغاذية15,16. تسمح هذه التقنية بتغيير قوي في التعبير الجيني المشيمي في وقت مبكر من التطور. تم استخدام تداخل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بشكل ضئيل في المشيمة. يمكن إجراء إدخال بلازميدات shRNA بشكل مشابه لتقنية CRIPSR الموضحة في هذه الورقة. وقد تم ذلك في E13.5 لتقليل تعبير PlGF بنجاح في المشيمة ، مع تأثيرات على الأوعية الدموية في الدماغالنسل 17.
بالإضافة إلى التقنيات التي تستخدم في المقام الأول للضربة القاضية أو الضربة القاضية ، يتم إجراء الإفراط في التعبير بشكل شائع مع الفيروسات الغدية أو إدخال بروتين خارجي. التقنيات المستخدمة للإفراط في التعبير لها معدلات نجاح متفاوتة وقد تم إجراؤها في الغالب في وقت لاحق من الحمل. للتحقيق في دور عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-1) في وظيفة المشيمة ، تم إجراء نقل جين المشيمة بوساطة غدية للحث على الإفراط في التعبير عن جين IGF-1 18,19. تم إجراء ذلك في وقت متأخر من حمل الفئران على E18.5 عن طريق حقن المشيمة المباشر. لتوفير خيارات إضافية والتحايل على الإخفاقات المحتملة للتلاعبات الجينية المشيمية الراسخة ، مثل فشل تركيبة Cre-Lox ، والسمية المحتملة للفيروسات الغدية ، والآثار غير المستهدفة ل shRNA ، يمكن استخدام معالجة CRISPR المباشرة للمشيمة في الجسم الحي 20،21،22. تم تطوير هذا النموذج لمعالجة عدم وجود نماذج الإفراط في التعبير ولإنشاء نموذج يتسم بالمرونة.
تعتمد هذه التقنية على عمل Lecuyer et al. ، حيث تم استهداف بلازميدات shRNA و CRISPR مباشرة في الجسم الحي إلى مشيمة الفئران لتغيير تعبير PlGF 17. يمكن استخدام هذه التقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة كريسبر في نقاط زمنية متعددة. لهذا العمل ، تم اختيار E12.5. نضجت المشيمة عند هذه النقطة وهي كبيرة بما يكفي للتلاعب بها ، مما يسمح بإدخال بلازميد كريسبر معين على E12.5 ، والذي يمكن أن يكون له تأثير كبير على نمو الجنين من منتصف إلى أواخر الحمل23,24. على عكس الأساليب المعدلة وراثيا ، ولكن على غرار التحريضات الفيروسية أو تداخل الحمض النووي الريبي ، تسمح هذه التقنية بالإفراط في التعبير أو الضربة القاضية في نقاط زمنية معينة باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، وبالتالي تجنب ضعف المشيمة المحتمل أو الفتك الجنيني من التغييرات السابقة. نظرا لأن عددا قليلا فقط من المشيمة يتلقى البلازميد التجريبي أو الرقابي داخل القمامة ، فإن النهج يسمح بنوعين من الضوابط الداخلية. هذه الضوابط هي تلك التي يتم حقنها وتزويدها بالكهرباء باستخدام بلازميد التحكم المناسب وتلك التي لا تتلقى أي معالجة مباشرة. تم تحسين هذه التقنية لإنشاء تعبير مفرط عن جين IGF-1 في مشيمة الفأر عبر وسيط التنشيط التآزري (SAM) CRISPR Plasmid. تم اختيار جين IGF-1 ، حيث أن IGF-1 هو هرمون نمو أساسي يتم تسليمه إلى الجنين ويتم إنتاجه بشكل أساسي في المشيمة قبل الولادة25,26. ستسمح تقنية كريسبر الجديدة التي تستهدف المشيمة بالتلاعب المباشر للمساعدة في تحديد العلاقة بين وظيفة المشيمة ونمو الجنين.
Protocol
Representative Results
Discussion
المشيمة هي المنظم الأساسي لنمو الجنين ، وكما لوحظ سابقا ، فإن التغيرات في التعبير الجيني للمشيمة أو وظيفتها قد تؤثر بشكل كبير على نمو الجنين6. يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا لإجراء معالجة مستهدفة في الجسم الحي بتقنية كريسبر لمشيمة الفأر باستخدام نهج جراحي متقدم نسبي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بمصادر التمويل التالية: R01 MH122435 و NIH T32GM008629 و NIH T32GM145441. يشكر المؤلفون مختبرات الدكتور فال شيفيلد والدكتور كالفن كارتر في جامعة أيوا على استخدام غرفة الجراحة والمعدات الخاصة بهم ، وكذلك الدكتور إريك فان أوترلو والدكتور نانداكومار نارايانان والدكتور ماثيو ويبر لمساعدتهم في الفحص المجهري. كما يشكر المؤلفون الدكتورة سارة ماورير ومايا إيفانز وسريليخا كوندو على مساعدتهم في العمليات الجراحية التجريبية.
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
- Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
