Laserablation und Intravitalmikroskopie zur Untersuchung des Darmumbaus

Dieses Protokoll kombiniert mikroskopische Laserablation und longitudinale intravitale Mikroskopie, um die intestinale Regeneration von der frühen Schadensreaktion bis hin zum langfristigen Gewebeumbau zu verfolgen. Die Technik wurde unter strikter Einhaltung ethischer Erwägungen entwickelt, um eine mikroskopische Laserablation zu induzieren und abzubilden, und wenn sie präzise angewendet wird, wird das Wohlbefinden der Tiere erhalten. Während der Operation ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Integrität des Darms gut erhalten bleibt. Dies kann durch eine schonende Behandlung des Gewebes mit sterilen feuchten Wattestäbchen erreicht werden, wodurch ein Ausbluten oder Austrocknen des Gewebes verhindert wird. Das Ausmaß der laserinduzierten mikroskopischen Schädigung sollte auch sorgfältig beurteilt werden, indem die verschiedenen Darmschichten des Bereichs nach der Laserablation abgebildet werden. Wenn der Forscher die Häufigkeit der in diesem Protokoll beschriebenen Versuchsschritte anpassen möchte, sollte die Tierethikkommission des Instituts vor dem Versuch konsultiert werden, um die Auswirkungen auf das Wohlergehen festzustellen.

Die repetitive intravitale Mikroskopie ermöglicht es, die Gewebeerholung in derselben Maus über einen längeren Zeitraum zu überwachen. Wiederholte chirurgische Freilegung des Darms gewährt leicht einen optischen Zugang zum gesamten Darmtrakt. Gewebeinhärente Merkmale, wie z. B. das Gefäßsystem, dienen als Orientierungspunkte, um in jeder Bildgebungssitzung dieselben Darmregionen zu identifizieren. So kann die gleiche Geweberegion über mehrere Wochen abgebildet werden, was es ermöglicht, die langfristige Geweberegeneration im gleichen Darmbereich derselben Maus zu quantifizieren. Die räumlich-zeitliche Kontrolle, die die kombinierte chirurgische und bildgebende Methode bietet, bringt den Vorteil, dass dasselbe Organ sowohl unter homöostatischen als auch unter regenerierenden Bedingungen in derselben Maus abgebildet werden kann, was im Gegensatz zu früheren Modellen zur Schädigung ganzer Organe steht, bei denen Kontrollen und regenerierende Proben von verschiedenen Mäusen stammen 11,12,18,19,20 . Daher minimiert unser Versuchssetting die erforderliche Anzahl von Tieren, die für den Versuch benötigt werden, und reduziert die Variation innerhalb des Tieres.

Die Fehlerbehebung im Protokoll sollte mit einer Überprüfung der Maus- und Darmhandhabungstechnik sowie einer Kontrolle der Mikroskopiegeräte und -einstellungen beginnen. Es gibt viele kritische Schritte in diesem Protokoll, die besondere Aufmerksamkeit erfordern. Um das Wohlergehen der Tiere und eine gleichbleibend hohe Datenqualität zu gewährleisten, müssen alle Arbeiten in einer sauberen, sterilen Umgebung mit aseptischer Technik durchgeführt werden, und die Temperatur der Maus sollte während der Operation und jeder Bildgebungssitzung aufrechterhalten werden. Es ist wichtig, das Gewebe während der Bildgebung mit steriler, vorgewärmter Kochsalzlösung mit Feuchtigkeit zu versorgen und Gewebefibrose zu verhindern.

Um sicherzustellen, dass das Experiment reproduzierbar durchgeführt wird, ist es wichtig, die Laser vor dem Einsatz für eine optimale Aufnahme auszurichten und die Leistungsabgabe des Multiphotonenlasers zu Beginn jeder Sitzung zu messen. Parameter wie die Art des Objektivs, die Vergrößerung, die Verweilzeit, die Laserleistung und die Wellenlänge haben Einfluss auf das Ausmaß der mikroskopischen Laserablation und sollten berücksichtigt werden. In dieser Studie werden sowohl die Laserablation als auch die Bildgebung mit einer Laserleistung von 1,2 W (außerhalb des Objektivs) bei einer Wellenlänge von 960 nm durch ein Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER-Objektiv durchgeführt. Die Änderung der Wellenlänge oder der optischen Abtasteigenschaften wirkt sich auf das Ausmaß der mikroskopischen Schädigung aus. Eine niedrigere Wellenlänge (z. B. 840 nm) führt zu Photonen mit höherer Energie und oft zu einer höheren Leistung des Lasers und kann mikroskopische Schäden verstärken. Ein höherer Zoom führt zu mehr Energie pro Region und damit zu weniger Zeit zum Abtragen von Krypten und umgekehrt. Die Verweildauer der Pixel kann auch erhöht oder verringert werden, um die Geschwindigkeit der Ablation und das Ausmaß des Schadens zu ändern. Wenn das abgebildete Gewebe nicht stabil ist (z. B. aufgrund peristaltischer Bewegungen), muss die Ablation schnell durchgeführt werden. Dazu sollte die Ablationsgeschwindigkeit optimiert werden, indem z.B. der Zoom- und/oder Laserausgang erhöht wird.

Die Entdeckung derselben Darmregion über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg ist ein weiterer wichtiger Schritt, der ordnungsgemäß ausgeführt werden muss, um den Erfolg des Experiments sicherzustellen. Dazu muss der Darm zu jedem Zeitpunkt exakt gleich positioniert werden. Wir empfehlen, immer den Blinddarm als Bezugspunkt zu verwenden, um die gleichen Regionen im Dünn- und Dickdarm zu finden. Durch die sanfte Dehnung des Gewebes mit Wattestäbchen wird sichergestellt, dass sich der interessierende Bereich im Bereich des objektiven Arbeitsabstands befindet, und die Anzahl der Regionen, die zurückverfolgt werden können, maximiert. Darüber hinaus empfehlen wir, immer mehrere mikroskopische Positionen in jeder Maus abzutragen und abzubilden, um Regionen zu berücksichtigen, die in einer späteren Bildgebungssitzung möglicherweise nicht lokalisiert werden. Wenn die Regionen nicht gefunden werden können, obwohl die Positionierung des Darms korrekt ist, kann es helfen, die Maus neu zu positionieren und die Ausrichtung des exponierten Bereichs zu ändern. Das Verfolgen von Krypten im Laufe der Zeit kann bei Experimenten, bei denen größere Darmfelder mehrerer benachbarter Krypten abgetragen werden, mühsam sein. Solche schädlichen Beleidigungen können einen Gewebeumbau über die epitheliale Monoschicht hinaus hervorrufen, was in einer Modifikation der Gewebeorientierungspunkte gipfeln kann, die für die Verfolgung der Region im Laufe der Zeit verwendet werden. Die Wahl von Orientierungspunkten in ausreichendem Abstand zur Schadstelle und die Erfassung größerer Sichtfelder, die die Schadstelle um mehrere hundert Mikrometer übertreffen, erhöht die Chance auf erfolgreiche Langzeitexperimente. Neben einer falschen Positionierung des Darms auf dem Mikroskoptisch können peristaltische Bewegungen des Magen-Darm-Trakts die Bildgebung beeinträchtigen. Dieses Problem kann auf zwei Arten gemildert werden. Wenn die Häufigkeit der Bewegungen nicht zu hoch ist, kann der Vorgang in derselben Region mit einer längeren Belichtungszeit wiederholt werden. Alternativ können höhere Mengen an Anästhesie verwendet werden, um die Peristaltik zu verringern. Wir empfehlen, höhere Dosen von Isofluran auf kurze Anpassungen zu beschränken. Insgesamt sollten die Bildgebungssitzungen so kurz wie möglich gehalten werden, am besten unter 3 h, um eine schnelle Genesung zu gewährleisten.

Der kombinierte Ansatz der Laserablation und der longitudinalen intravitalen Mikroskopie hat im Vergleich zu anderen Schädigungsmodellen mehrere Vorteile. Bisherige (chemische) Schadensmodelle waren nicht in der Lage, die schädigende Beleidigung lokal einzugrenzen 6,11,12,19,20. Die Laserablation überwindet dieses Manko, indem sie die Schädigung auf eine definierte Region von Interesse beschränkt. Dies ermöglicht es den Forschern, den Ort der Verletzung sowie das Ausmaß des Schadens zu kontrollieren. Die Schwere der Schädigung kann moduliert werden, um Krypten oder ganze mikroskopisch kleine Darmfelder abzulieren, um über regenerative Reaktionen auf der Kryptenskala zu informieren. Neben der räumlichen Kontrolle ermöglicht die Laserablation auch ein präzises Timing des Auftretens von Schäden und übertrifft damit die Präzision früherer Arzneimittel-, Chemikalien- und Infektionsmodelle 9,10,11,12,19,20. Unser Protokoll baut auf früheren Studien auf, in denen laserinduzierte Thermoablation als Methode zur Induktion lokalisierter Schäden im Darm eingesetzt wurde^21,23. Bisherige laserinduzierte Schädigungsmodelle bildeten lokale Bereiche im Dünndarm²¹ oder die luminale Oberfläche des distalen Kolons²³ ab. Der kombinierte Ansatz der Chirurgie und Laserablation ermöglicht es, das Darmepithel (insbesondere Krypten) mit hoher Auflösung zu visualisieren und eine Laserablation und Nachsorgebildgebung der Gewebegewinnung in jeder Position des Dünndarms, des Blinddarms und des proximalen Dickdarms durchzuführen. Es erfasst die Erholung derselben Darmregionen im Laufe der Zeit und ermöglicht es, verschiedene Schichten des Darms (Mukosa, Submukosa, Muscularis und Serosa) gemäß dem Versuchsaufbau sichtbar zu machen. Unsere Technik ist hauptsächlich auf die Langzeit-Bildwiederholung über einen Zeitraum von mehreren Wochen/Monaten zugeschnitten. Um die kurzfristige Erholungsdynamik von Krypten (z.B. für mehrere aufeinanderfolgende Tage nach einer Schädigung) zu untersuchen, kann der hier beschriebene Laserablationsansatz mit intravitalen Bildgebungsfenstern^{kombiniert werden 27,28,40}.

Dieses Protokoll kann für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen aus verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen verwendet werden, die Regeneration, Immunologie und Krebsforschung umfassen. Die longitudinale Bildgebung der intestinalen Regeneration gibt Aufschluss über die zelluläre Dynamik, die die epitheliale Integrität und Barrierefunktion bewahrt, die Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger im Darmlumen ermöglicht und die der Beseitigung und Ausbreitung onkogener Mutationen zugrunde liegt. Jede wissenschaftliche Fragestellung stellt einzigartige Anforderungen an das Ausmaß der laserinduzierten Schädigung und die Dauer der Bildgebung. Fluoreszierende Reportermäuse und injizierte Farbstoffe können die erfassten Daten drastisch erweitern und verfeinern, indem sie die Visualisierung jeder Zelle und Struktur von Interesse ermöglichen. So kann beispielsweise eine Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti-Maus zur Visualisierung von Stammzellnachkommen verwendet werden, während der Rosa26-mTmG-Reporter über die Gewebearchitektur informiert. Zusammen machen diese jüngsten technologischen Fortschritte intravitale Darmexperimente zu einem lukrativen Werkzeug, um unser Verständnis der Darmbiologie und -krankheit zu verbessern.