Laserablatie en intravitale microscopie om intestinale remodellering te bestuderen

Dit protocol combineert microscopische laserablatie en longitudinale intravitale microscopie om intestinale regeneratie te volgen van vroege schaderespons tot weefselremodellering op lange termijn. De techniek is vastgesteld in strikte naleving van ethische overwegingen om microscopische laserablatie te induceren en in beeld te brengen, en wanneer het precies wordt gevolgd, zal het welzijn van dieren worden gehandhaafd. Tijdens de operatie is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de integriteit van de darm goed bewaard blijft. Dit kan worden bereikt door het weefsel voorzichtig te hanteren met steriele natte wattenstaafjes, wat bloeden of uitdrogen van het weefsel voorkomt. De omvang van lasergeïnduceerde microscopische schade moet ook zorgvuldig worden beoordeeld door de verschillende darmlagen van het gebied na laserablatie in beeld te brengen. Indien de onderzoeker de frequentie van de in dit protocol beschreven experimentele stappen wenst aan te passen, dient de dierethische commissie van het instituut vóór het experiment te worden geraadpleegd om de gevolgen voor het welzijn vast te stellen.

Repetitieve intravitale microscopie maakt het mogelijk om weefselherstel in dezelfde muis in de loop van de tijd te volgen. Herhaalde chirurgische blootstelling van de darm verleent gemakkelijk optische toegang tot het hele darmkanaal. Weefselinherente kenmerken, zoals de vasculatuur, dienen als oriëntatiepunten om dezelfde darmgebieden in elke beeldvormingssessie te identificeren. Zo kan hetzelfde weefselgebied gedurende meerdere weken in beeld worden gebracht, waardoor men langdurige weefselregeneratie in hetzelfde darmgebied in dezelfde muis kan kwantificeren. De spatiotemporale controle die wordt geboden door de gecombineerde chirurgie- en beeldvormingsmethode brengt het voordeel met zich mee dat hetzelfde orgaan kan worden afgebeeld onder zowel homeostatische als regenererende omstandigheden in dezelfde muis, wat in contrast staat met eerdere modellen voor schade aan hele organen waarbij controles en regenererende monsters afkomstig zijn van verschillende muizen 11,12,18,19,20 . Daarom minimaliseert onze experimentele setting het vereiste aantal dieren dat nodig is voor het experiment en vermindert het de variatie binnen dieren.

Het oplossen van protocolproblemen moet beginnen met een beoordeling van de techniek voor het hanteren van muizen en darmen en een controle van microscopieapparatuur en -instellingen. Er zijn veel kritieke stappen in dit protocol die extra aandacht vereisen. Ten eerste, om het welzijn van dieren en een continue hoge gegevenskwaliteit te garanderen, moet al het werk worden uitgevoerd in een schone, steriele omgeving met behulp van aseptische techniek en moet de muistemperatuur worden gehandhaafd tijdens de operatie en elke beeldvormingssessie. Het weefsel gehydrateerd houden met steriele, voorverwarmde zoutoplossing tijdens beeldvorming is essentieel en voorkomt weefselfibrose.

Om ervoor te zorgen dat het experiment op een reproduceerbare manier wordt uitgevoerd, is het belangrijk om de lasers voor gebruik uit te lijnen voor optimale acquisitie en om het vermogen van de multifotonenlaser aan het begin van elke sessie te meten. Parameters zoals het type van het doel, de vergroting, de verblijftijd, het laservermogen en de golflengte hebben invloed op de mate van microscopische laserablatie en moeten worden overwogen. In deze studie worden zowel laserablatie als beeldvorming uitgevoerd met een laservermogen van 1,2 W (uit de lens) bij een golflengte van 960 nm door een Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER-objectief. Het veranderen van de golflengte of optische scaneigenschappen beïnvloedt de mate van microscopische schade. Een lagere golflengte (zoals 840 nm) vertaalt zich in fotonen met een hogere energie en vaak in een hogere output van de laser, en kan microscopische schade versterken. Een hogere zoom resulteert in meer energie per regio, en dus minder tijd om crypten af te breken, en vice versa. De verblijftijd van de pixel kan ook worden verhoogd of verlaagd om de snelheid van ablatie en de omvang van de schade te veranderen. Wanneer het afgebeelde weefsel niet stabiel is (bijvoorbeeld vanwege peristaltische bewegingen), moet ablatie snel worden uitgevoerd. Hiervoor moet de ablatiesnelheid worden geoptimaliseerd door bijvoorbeeld de zoom- en/of laseroutput te verhogen.

Het vinden van hetzelfde darmgebied gedurende meerdere beeldvormingssessies is een andere cruciale stap die goed moet worden uitgevoerd om het succes van het experiment te garanderen. Om dit te doen, moet de darm op elk moment op exact dezelfde manier worden gepositioneerd. We raden aan om altijd de blindedarm als referentiepunt te gebruiken om dezelfde gebieden in de dunne en dikke darm te vinden. Het voorzichtig uitrekken van het weefsel van belang met wattenstaafjes zorgt ervoor dat het gebied van belang binnen het bereik van de objectieve werkafstand ligt en maximaliseert het aantal regio’s dat kan worden getraceerd. Daarnaast raden we aan om altijd meerdere microscopische posities in elke muis af te breken en in beeld te brengen om rekening te houden met regio’s die mogelijk niet zijn gelokaliseerd in een latere beeldvormingssessie. Als de regio’s niet kunnen worden gevonden, hoewel de positionering van de darm correct is, kan het helpen om de muis te verplaatsen en de oriëntatie van het blootgestelde gebied te veranderen. Het volgen van crypten in de loop van de tijd kan omslachtig zijn voor experimenten waarbij grotere darmvelden van verschillende aangrenzende crypten worden geableerd. Dergelijke schadelijke beledigingen kunnen weefselremodellering buiten de epitheliale monolaag oproepen, wat kan culmineren in wijziging van de weefseloriëntatiepunten die worden gebruikt voor het volgen van het gebied in de loop van de tijd. Het kiezen van oriëntatiepunten op voldoende afstand van de beschadigde site en het vastleggen van grotere gezichtsvelden die het beschadigde gebied met enkele honderden micrometers overtreffen, verhoogt de kans op succesvolle langetermijnexperimenten. Naast een onjuiste positionering van de darm op het microscoopstadium, kunnen peristaltische bewegingen van het maagdarmkanaal de beeldvorming verstoren. Dit probleem kan op twee manieren worden verholpen. Als de frequentie van bewegingen niet te hoog is, kan het proces worden herhaald in hetzelfde gebied met een verhoogde blootstellingstijd. Als alternatief kunnen grotere hoeveelheden anesthesie worden gebruikt om de peristaltiek te verminderen. We raden aan om hogere doses isofluraan te beperken tot korte aanpassingen. Al met al moeten de beeldvormingssessies zo kort mogelijk worden gehouden, optimaal onder de 3 uur, om een snel herstel te garanderen.

De gecombineerde laserablatie en longitudinale intravitale microscopiebenadering heeft verschillende voordelen in vergelijking met andere schademodellen. Eerdere (chemische) schademodellen misten het vermogen om de schadelijke belediging lokaal te beperken 6,11,12,19,20. Laserablatie overwint deze tekortkoming door de schade te beperken tot een bepaald interessegebied. Dit stelt onderzoekers in staat om de locatie van het letsel te controleren, evenals de omvang van de schade. De ernst van de schade kan worden gemoduleerd om crypten of hele microscopische darmvelden te aborteren om te informeren over regeneratieve reacties op crypteschaal. Naast ruimtelijke controle maakt laserablatie het ook mogelijk om het begin van schade nauwkeurig te timen, waardoor de precisie van eerdere medicijn-, chemische en infectiemodellen 9,10,11,12,19,20 wordt overtroffen. Ons protocol borduurt voort op eerdere studies die laser-geïnduceerde thermische ablatie gebruikten als een methode om gelokaliseerde schade in de darm te induceren^21,23. Eerdere laser-geïnduceerde schademodellen brachten lokale gebieden in de dunne darm²¹ of het luminale oppervlak van de distale dikke darm²³ in beeld. De gecombineerde chirurgie- en laserablatiebenadering maakt het mogelijk om het darmepitheel (met name crypten) met een hoge resolutie te visualiseren en laserablatie en follow-up beeldvorming van weefselherstel uit te voeren in elke positie van de dunne darm, blindedarm en proximale dikke darm. Het vangt het herstel van dezelfde darmgebieden in de loop van de tijd, waardoor verschillende lagen van de darm (slijmvlies, submucosa, muscularis en serosa) kunnen worden gevisualiseerd volgens de experimentele opstelling. Onze techniek is voornamelijk toegesneden op langdurige herhaalde beeldvorming gedurende een periode van meerdere weken/maanden. Om de kortetermijnhersteldynamiek van crypten te bestuderen (bijvoorbeeld gedurende meerdere opeenvolgende dagen na schade), kan de hier beschreven laserablatiebenadering worden gecombineerd met intravitale beeldvormingsvensters^27,28,40.

Dit protocol kan worden gebruikt voor een groot aantal onderzoekstoepassingen uit verschillende wetenschappelijke gebieden die regeneratie, immunologie en kankeronderzoek omvatten. Longitudinale beeldvorming van intestinale regeneratie werpt licht op de cellulaire dynamiek die de epitheliale integriteit en barrièrefunctie behoudt, de afweer van de gastheer tegen pathogenen in het darmlumen mogelijk maakt en die ten grondslag ligt aan de klaring en verspreiding van oncogene mutaties. Elke wetenschappelijke vraag zal unieke eisen stellen aan de omvang van laser-geïnduceerde schade en de duur van de beeldvorming. Fluorescerende reportermuizen en geïnjecteerde kleurstoffen kunnen de gegevens die kunnen worden verkregen drastisch uitbreiden en verfijnen door de visualisatie van elke cel en structuur van belang mogelijk te maken. Een Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti-muis kan bijvoorbeeld worden gebruikt om stamcelprogenieën te visualiseren, terwijl de Rosa26-mTmG-reporter informeert over weefselarchitectuur. Samen maken deze recente technologische ontwikkelingen intravitale darmexperimenten tot een lucratief hulpmiddel om ons begrip van darmbiologie en -ziekte te vergroten.