In vitro Investigação dos Efeitos da Matriz Extracelular Rica em Hialuronano na Migração de Células da Crista Neural
Summary
Este protocolo descreve um experimento de migração in vitro adequado para a análise funcional das moléculas envolvidas na migração in vivo de células da crista neural para a matriz extracelular rica em hialuronano.
Abstract
As células da crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que se originam da região dorsal do tubo neural. A emigração de NCCs do tubo neural é um processo essencial para a produção de NCC e sua subsequente migração para os locais alvo. A rota migratória das NCCs, incluindo os tecidos do tubo neural circundantes, envolve matriz extracelular rica em hialuronano (AH). Para modelar a migração de NCC para esses tecidos circundantes ricos em AH a partir do tubo neural, um ensaio misto de migração de substrato consistindo de AH (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) e colágeno tipo I (Col1) foi estabelecido neste estudo. Este ensaio de migração demonstra que as células da linhagem celular NCC, O9-1, são altamente migratórias sobre o substrato misto e que o revestimento do AH é degradado no local das aderências focais no curso da migração. Este modelo in vitro pode ser útil para uma maior exploração das bases mecanicistas envolvidas na migração de NCC. Este protocolo também é aplicável para avaliar diferentes substratos como scaffolds para estudar a migração de NCC.
Introduction
As células da crista neural (NCCs) são uma população celular multipotente que está presente em embriões em desenvolvimento, e se originam da borda da placa neural durante a neurulação. Contribuem para a formação de uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso periférico, o sistema cardiovascular, os tecidos craniofaciais e o esqueleto1. Após indução e especificação da NCC na borda da placa neural, as NCCs emigram do neuroepitélio e migram para sítios teciduais derivados da NCC1.
O hialuronano (AH) é um glicosaminoglicano não sulfatado que se distribui em uma variedade de tecidos como componente da matriz extracelular (MEC). A importância do AH no desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada em sistemas modelo através da ablação de genes responsáveis pelo metabolismo do hialuronano. Por exemplo, mutações nos genes hialuronano sintase (Has1 e Has2) em Xenopus levaram a defeitos de migração de NCC e malformação craniofacial2. Além disso, os proteoglicanos ligantes de AH, agrecan e versican, têm sido relatados como exercendo efeitos inibitórios sobre a migração de NCC3. Em camundongos, a ablação de Has2 leva a graves defeitos na formação do coxim endocárdico, resultando em letalidade no meio da gestação (E9,5-10)4,5,6.
A proteína transmembrana 2 (Tmem2), uma hialuronidase de superfície celular, demonstrou recentemente desempenhar um papel crítico na promoção da adesão e migração de células cancerosas mediadas por integrinas, removendo o AH associado à matriz nos sítios de adesão 7,8. Mais recentemente, Inubushi et al.9 demonstraram que a deficiência de Tmem2 leva a graves defeitos craniofaciais devido a anormalidades na emigração/migração e sobrevida das NCC. No estudo anterior9, a expressão de Tmem2 foi analisada durante a formação e migração de NCC. A expressão de Tmem2 foi observada no local de delaminação de NCC e em NCCs Sox9-positivos emigrados (Figura 1). Além disso, utilizando células da crista neural O9-1 de camundongos depletadas de Tmem2, o estudo demonstrou que a expressão in vitro de Tmem2 foi essencial para que as células O9-1 formassem aderências focais e para sua migração para substratos contendo AH (Figura 2 e Figura 3)9.
Esses resultados indicam fortemente que o Tmem2 também é importante para a adesão e migração do NCC através da MEC rica em AH. No entanto, o mecanismo molecular de adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH ainda não está claro. Portanto, é necessário estabelecer um sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente a adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH.
Das inúmeras abordagens empregadas no teste da migração celular, o ensaio baseado no fechamento de feridas celulares é um método simples e frequentemente utilizado nos campos da fisiologia eoncologia10. Essa abordagem é útil devido à sua relevância para o fenótipo in vivo e é eficaz na determinação do papel de drogas e quimioatrativos durante a migração celular11. É possível avaliar a capacidade de migração tanto de massas celulares inteiras quanto de células individuais medindo as distâncias de gap celular ao longo do tempo11. Neste manuscrito, um ensaio modificado in vitro baseado no fechamento de feridas é introduzido para modelar a migração de NCC para tecidos ricos em AH ao redor do tubo neural. Esse procedimento também é aplicável para estudar diferentes componentes da MEC (i.e., colágenos, fibronectina e laminina) para analisar o papel do arcabouço da MEC na migração da NCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vários componentes do ECM regulam a emigração/migração do NCC. Por exemplo, o AH regula positivamente a migração deNCC2,15. Curiosamente, um estudo baseado em modelos genéticos murinos de Tmem2, uma hialuronidase de superfície celular, elucidou a exigência de degradação do AH na migração deNCC9. Os colágenos também são abundantes na MEC ao redor do tubo neural16. Demonstrou-se que a decorina, um peq…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expresso grande reconhecimento a Fumitoshi Irie e Yu Yamaguchi por seu encorajamento e sugestões gentis no estabelecimento deste método. Este trabalho foi apoiado por bolsas de auxílio para programas de pesquisa científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (#19KK0232 para T.I., #20H03896 para T.I.). O método original para o revestimento de AH em substratos de vidro e ensaios de degradação in situ de AH nos substratos foi descrito em Yamamoto et al (2017)8, enquanto o método para a preparação de substratos mistos HA/Col1 foi descrito em Irie et al (2021)7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Biologie du développement. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
