In Vitro Hyaluronan Bakımından Zengin Hücre Dışı Matriksin Nöral Kret Hücre Migrasyonu Üzerine Etkilerinin İncelenmesi
Summary
Bu protokol, nöral krest hücrelerinin hyaluronan bakımından zengin hücre dışı matrise in vivo göçünde rol oynayan moleküllerin fonksiyonel analizi için uygun bir in vitro migrasyon deneyini özetlemektedir.
Abstract
Nöral krest hücreleri (NCC’ler), nöral tüpün dorsal bölgesinden kaynaklanan yüksek oranda göçmen hücrelerdir. NCC’lerin nöral tüpten göçü, NCC üretimi ve ardından hedef bölgelere doğru göçleri için önemli bir süreçtir. Çevreleyen nöral tüp dokuları da dahil olmak üzere NCC’lerin göç yolu, hyaluronan (HA) bakımından zengin hücre dışı matriksi içerir. Bu çalışmada, nöral tüpten HA bakımından zengin bu çevre dokulara NCC migrasyonunu modellemek için, HA (ortalama moleküler ağırlık: 1.200-1.400 kDa) ve kollajen tip I’den (Col1) oluşan karışık bir substrat migrasyon testi yapılmıştır. Bu migrasyon testi, NCC hücre hattının, O9-1 hücrelerinin, karışık substrat üzerinde yüksek oranda göçmen olduğunu ve HA kaplamasının göç sırasında fokal adezyonlar bölgesinde bozulduğunu göstermektedir. Bu in vitro model, NCC göçünde yer alan mekanik temelin daha fazla araştırılması için yararlı olabilir. Bu protokol, NCC göçünü incelemek için farklı substratları iskele olarak değerlendirmek için de geçerlidir.
Introduction
Nöral krest hücreleri (NCC’ler), gelişmekte olan embriyolarda bulunan multipotent bir hücre popülasyonudur ve nörülasyon sırasında nöral plak sınırından köken alırlar. Periferik sinir sistemi, kardiyovasküler sistem, kraniyofasiyal dokular ve iskelet1 dahil olmak üzere çeşitli dokuların oluşumuna katkıda bulunurlar. Nöral plak sınırında indüksiyon ve NCC spesifikasyonundan sonra, NCC’ler nöroepitelden göç eder ve NCC kaynaklı doku bölgelerine doğru göç eder1.
Hyaluronan (HA), hücre dışı matriksin (ECM) bir bileşeni olarak çeşitli dokulara dağılmış sülfatlanmamış bir glikozaminoglikandır. HA’nın embriyo gelişimindeki önemi, hyaluronan metabolizmasından sorumlu genlerin ablasyonu yoluyla model sistemlerde gösterilmiştir. Örneğin, Xenopus’taki hyaluronan sentaz genlerindeki (Has1 ve Has2) mutasyonların NCC migrasyon kusurlarına ve kraniyofasiyal malformasyon2’ye yol açtığı bulunmuştur. Ek olarak, HA bağlayıcı proteoglikanlar, agrekan ve versikanın, NCC migrasyonu3 üzerinde inhibitör etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Farelerde, Has2 ablasyonu endokardiyal yastık oluşumunda ciddi kusurlara yol açarak gebeliğin ortasında (E9.5-10) öldürücülük 4,5,6 ile sonuçlanır.
Bir hücre yüzeyi hyaluronidaz olan transmembran protein 2’nin (Tmem2), yakın zamanda, yapışma bölgelerinde matriksle ilişkili HA’yı çıkararak integrin aracılı kanser hücresi yapışmasını ve göçünü teşvik etmede kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir 7,8. Daha yakın zamanlarda, Inubushi ve ark.9, Tmem2’deki bir eksikliğin, NCC göçü / göçü ve sağkalımındaki anormallikler nedeniyle ciddi kraniyofasiyal defektlere yol açtığını göstermiştir. Önceki çalışmada9, NCC oluşumu ve migrasyonu sırasında Tmem2 ekspresyonu analiz edilmiştir. Tmem2 ekspresyonu, NCC delaminasyon bölgesinde ve Sox9-pozitif NCC’lerin göç etmesinde gözlendi (Şekil 1). Ek olarak, Tmem2-tükenmiş fare O9-1 nöral krest hücrelerini kullanarak, çalışma, Tmem2’nin in vitro ekspresyonunun, O9-1 hücrelerinin fokal adezyonlar oluşturması ve HA içeren substratlara göçleri için gerekli olduğunu göstermiştir (Şekil 2 ve Şekil 3)9.
Bu sonuçlar, Tmem2’nin NCC yapışması ve HA bakımından zengin ECM yoluyla migrasyon için de önemli olduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir. Bununla birlikte, HA bakımından zengin ECM içindeki NCC yapışması ve göçünün moleküler mekanizması hala belirsizdir. Bu nedenle, HA bakımından zengin ECM içinde NCC yapışmasını ve göçünü tam olarak araştırmak için bir in vitro kültür deneysel sistemi kurmak gereklidir.
Hücre göçünü test etmede kullanılan sayısız yaklaşımdan, hücre yarası kapatma temelli tahlil, fizyoloji ve onkoloji alanlarında sıklıkla kullanılan basit bir yöntemdir10. Bu yaklaşım, in vivo fenotiple ilgisi nedeniyle yararlıdır ve hücre göçü sırasında ilaçların ve kemoattractanların rollerinin belirlenmesinde etkilidir11. Hem tüm hücre kütlelerinin hem de tek tek hücrelerin migrasyon kabiliyetini, zaman içindeki hücre boşluk mesafelerini ölçerek değerlendirmek mümkündür11. Bu makalede, nöral tüpü çevreleyen HA bakımından zengin dokulara NCC migrasyonunu modellemek için modifiye edilmiş in vitro yara kapatma temelli bir tahlil tanıtılmıştır. Bu prosedür, ECM iskelesinin NCC göçündeki rolünü analiz etmek için farklı ECM bileşenlerini (yani, kollajenler, fibronektin ve laminin) incelemek için de geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli ECM bileşenleri NCC göçünü/göçünü düzenler. Örneğin, HA, NCC göçünü 2,15 pozitif olarak düzenler. İlginç bir şekilde, bir hücre yüzeyi hyaluronidaz olan Tmem2’nin genetik fare modellerine dayanan bir çalışma, NCC migrasyonunda HA bozunmasının gerekliliğini aydınlatmıştır9. Kollajenler ayrıca nöral tüp16’yı çevreleyen ECM’de de bol miktarda bulunur. Küçük bir lösin b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fumitoshi Irie ve Yu Yamaguchi’ye bu yöntemin oluşturulmasındaki teşvikleri ve nazik önerileri için büyük teşekkürlerimi sunuyorum. Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği’nden (#19KK0232 T.I.’a, #20H03896 T.I.’a) bilimsel araştırma programları için hibe yardımı ile desteklenmiştir. HA’nın cam substratlar üzerine kaplanması ve substratlar üzerindeki in situ HA bozunma tahlilleri için orijinal yöntem Yamamoto et al. (2017) 8’de tarif edilirken, HA / Col1 karışık substratlarının hazırlanması için yöntem Irie et al. (2021) 7’de açıklanmıştır.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Biologie du développement. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
