체외 히알루로난이 풍부한 세포외 기질이 신경 능선 세포 이동에 미치는 영향에 대한 조사
Summary
이 프로토콜은 신경 능선 세포가 히알루로난이 풍부한 세포외 기질로의 생체 내 이동에 관여하는 분자의 기능 분석에 적합한 시험관 내 이동 실험을 설명합니다.
Abstract
신경능선세포(NCC)는 신경관의 등쪽 영역에서 유래하는 이동성이 높은 세포입니다. 신경관에서 NCC를 이동하는 것은 NCC 생산 및 표적 부위로의 후속 이동을 위한 필수 과정입니다. 주변 신경관 조직을 포함한 NCC의 이동 경로에는 히알루론산(HA)이 풍부한 세포외 기질이 포함됩니다. 신경관에서 이러한 HA가 풍부한 주변 조직으로의 NCC 이동을 모델링하기 위해 HA(평균 분자량: 1,200-1,400kDa)와 콜라겐 유형 I(Col1)로 구성된 혼합 기질 이동 분석이 이 연구에서 확립되었습니다. 이 이동 분석은 NCC 세포주인 O9-1 세포가 혼합 기질에서 고도로 이동하며 HA 코팅이 이동 과정에서 국소 접착 부위에서 분해됨을 보여줍니다. 이 시험관 내 모델은 NCC 마이그레이션과 관련된 기계적 기반에 대한 추가 탐색에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 NCC 이동을 연구하기 위해 스캐폴드로 다양한 기질을 평가하는 데에도 적용할 수 있습니다.
Introduction
신경 능선 세포(NCC)는 발달 중인 배아에 존재하는 다능성 세포 집단이며 신경 형성 동안 신경판 경계에서 유래합니다. 그들은 말초 신경계, 심혈관계, 두개 안면 조직 및 골격을 포함한 다양한 조직의 형성에 기여합니다1. 신경판 경계에서 유도 및 NCC 사양 후, NCC는 신경 상피에서 이동하여 NCC 유래 조직 부위로 이동합니다1.
히알루론산(HA)은 세포외 기질(ECM)의 구성 요소로서 다양한 조직에 분포하는 비황산화 글리코사미노글리칸입니다. 배아 발달에서 HA의 중요성은 히알루론산 대사를 담당하는 유전자의 절제를 통해 모델 시스템에서 입증되었습니다. 예를 들어, 제노푸스(Xenopus)의 히알루론산 합성효소 유전자(Has1 및 Has2)의 돌연변이는 NCC 이동 결함과 두개안면 기형을 유발하는 것으로 밝혀졌다2. 또한, HA 결합 프로테오글리칸인 아그레칸(aggrecan)과 베르시칸(versican)은 NCC 이동에 대한 억제 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다3. 마우스에서 Has2 절제는 심내막 쿠션 형성에 심각한 결함을 일으켜 임신 중기(E9.5-10) 치사율을 초래합니다 4,5,6.
세포 표면 히알루로니다아제인 막횡단 단백질 2(Tmem2)는 부착 부위 7,8에서 매트릭스 관련 HA를 제거하여 인테그린 매개 암세포 부착 및 이동을 촉진하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 최근 입증되었습니다. 보다 최근에, Inubushi et al.9는 Tmem2의 결핍이 NCC 이주/이주 및 생존의 이상으로 인해 심각한 두개안면 결함을 유발한다는 것을 입증했습니다. 이전 연구9에서, Tmem2 발현은 NCC 형성 및 이동 동안 분석되었다. Tmem2 발현은 NCC 박리 부위 및 이주하는 Sox9 양성 NCC에서 관찰되었습니다(그림 1). 또한, Tmem2가 고갈된 마우스 O9-1 신경 능선 세포를 사용하여 연구에서는 Tmem2의 시험관 내 발현이 O9-1 세포가 국소 유착을 형성하고 HA 함유 기질로 이동하는 데 필수적임을 입증했습니다(그림 2 및 그림 3)9.
이러한 결과는 Tmem2가 HA가 풍부한 ECM을 통한 NCC 접착 및 이동에도 중요하다는 것을 강력하게 나타냅니다. 그러나 HA가 풍부한 ECM 내에서 NCC 접착 및 이동의 분자 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 따라서 HA가 풍부한 ECM 내에서 NCC 접착 및 이동을 완전히 탐색하기 위해 체외 배양 실험 시스템을 구축할 필요가 있습니다.
세포 이동을 검사하는 데 사용되는 수많은 접근법 중에서, 세포 상처 봉합 기반 분석법은 생리학 및 종양학 분야에서 자주 사용되는 간단한 방법이다10. 이 접근법은 생체 내 표현형과의 관련성으로 인해 유용하며 세포 이동 동안 약물 및 화학 유인 물질의 역할을 결정하는 데 효과적이다11. 시간 경과에 따른 세포 갭 거리를 측정함으로써 전체 세포 질량과 개별 세포 모두의 이동 능력을 평가할 수 있다11. 이 원고에서는 신경관을 둘러싼 HA가 풍부한 조직으로의 NCC 이동을 모델링하기 위해 수정된 시험관 내 상처 봉합 기반 분석이 도입되었습니다. 이 절차는 NCC 이동에서 ECM 스캐폴드의 역할을 분석하기 위해 다양한 ECM 구성 요소(즉, 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌)를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양한 ECM 구성 요소가 NCC 마이그레이션/마이그레이션을 규제합니다. 예를 들어, HA는 NCC 마이그레이션 2,15를 긍정적으로 규제합니다. 흥미롭게도, 세포 표면 히알루로니다아제인 Tmem2의 유전자 마우스 모델을 기반으로 한 연구는 NCC 이동에서 HA 분해의 필요성을 설명했다9. 콜라겐은 또한 신경관을 둘러싸고 있는 ECM에 풍부하다<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 방법을 수립하는 데 격려와 친절한 제안을 해주신 이리에 후미토시와 야마구치 유에게 큰 감사를 표합니다. 이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (#19KK0232에서 TI까지, #20H03896에서 TI까지)의 과학 연구 프로그램에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 유리 기판에 HA를 코팅하고 기판에 대한 현장 HA 분해 분석을 위한 원래 방법은 Yamamoto et al. (2017)8, HA/Col1 혼합 기판의 제조 방법은 Irie et al. (2021)7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Biologie du développement. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
