ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング
Summary
CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0 CRISPR注入ゼブラフィッシュ精子の生殖系列編集を迅速にスクリーニングするための堅牢な方法について説明しています。
Abstract
標的CRISPR-Casヌクレアーゼ技術の出現は、確立されたモデルシステムと新しいモデルシステムの両方で正確なゲノム編集を実行する能力に革命をもたらしました。CRISPR-Casゲノム編集システムは、合成ガイドRNA(sgRNA)を使用して、CRISPR関連(Cas)エンドヌクレアーゼを特定のゲノムDNA遺伝子座に標的化し、そこでCasエンドヌクレアーゼが二本鎖切断を生成します。固有のエラーが発生しやすいメカニズムによる二本鎖切断の修復は、挿入および/または欠失につながり、遺伝子座を破壊します。あるいは、このプロセスに二本鎖DNAドナーまたは一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを含めることで、一塩基多型から小さな免疫学的タグ、さらには大きな蛍光タンパク質構築物に至るまでの正確なゲノム編集を含めることができます。ただし、この手順の主なボトルネックは、生殖細胞系列で目的の編集を見つけて分離することです。このプロトコルは、 ダニオレリオ (ゼブラフィッシュ)の特定の遺伝子座で生殖細胞系列の突然変異をスクリーニングおよび分離するための堅牢な方法を概説しています。しかしながら、これらの原理は、 in vivo 精子採取が可能な任意のモデルにおいて適応可能である可能性がある。
Introduction
CRISPR(クラスター化された規則的間隔の短い回文反復)/Casシステムは、ダニオレリオ(ゼブラフィッシュ)モデルシステム1,2,3,4で遺伝子座特異的突然変異誘発と正確なゲノム編集を行うための強力なツールです。Cas-リボ核タンパク質(RNP)は、Casエンドヌクレアーゼ(一般にCas9またはCas12a)と遺伝子座特異的合成ガイドRNA(sgRNA)5の2つの主要成分で構成されています。一緒に、Cas-RNPは、2つの固有の修復メカニズムのうちの1つによって修復することができる所望の遺伝子座に二本鎖切断(DSB)を生成する。非相同末端結合(NHEJ)修復メカニズムはエラーが発生しやすく、DSBの周囲にさまざまな挿入または欠失(インデル)が生じることがよくあります。これらのインデルは、結果として生じるタンパク質配列にフレームシフト変異または早期停止を導入すると有害になる可能性があります。あるいは、相同性指向修復(HDR)機構は、損傷を修復するためにDSB部位を取り囲む相同性の領域を有するドナーテンプレートを使用する。研究者はHDRシステムを利用して、正確なゲノム編集を生成できます。具体的には、ゲノム中のDSB部位に隣接する相同性領域と同様に、所望の編集を含む二本鎖DNAドナー構築物を共注入することができる。これらの商業的に生産されたCRISPRコンポーネントの規模の経済性の向上により、複数の遺伝子座をスクリーニングし、正確なゲノム編集のためのより大規模な取り組みを設定する際の障壁が大幅に減少しました。しかし、有性生殖動物モデルでは、生殖細胞系列に安定な変異動物の同定と単離が大きなボトルネックとなっています。
ゼブラフィッシュモデルシステムは、逆遺伝学的研究での使用を強化するいくつかの重要な性質を示します。基本的な水生飼育設備で大量飼育が容易で、雌は一年中高い繁殖力を示します6。さらに、それらの外部産卵および受精により、CRISPR / Cas成分のマイクロインジェクションに適しています。Cas-RNPは通常、1細胞期のゼブラフィッシュ胚に注入され、理論的にはすべての娘細胞に受け継がれるDSB /修復を生成します。しかし、二倍体ゲノムは、両方の相同染色体を変異化するために2つのDSB /修復イベントを必要とします。さらに、Cas-RNPは1細胞段階で注入されますが、DSB /修復は発生の後期まで起こらない可能性があります。一緒に、これらの要因はF0注入された魚のモザイクの性質に貢献します。一般的な方法は、F0を注入した魚をアウトクロスし、F1の子孫をインデル/特定の編集のためにスクリーニングすることです。ただし、すべてのF0注入魚が生殖系列の突然変異を持っているわけではないため、この方法では、目的の編集を生成しない多くの非生産的な交配が発生します。F1体細胞組織ではなくF0生殖細胞系列をスクリーニングすると、所望の生殖細胞系列編集を単離する確率が高まり、このプロセスに必要な動物数が減少します。
精子は、安楽死を必要とせずにF0注射ゼブラフィッシュから簡単に収集できます。この特徴は、凍結精子ストック7の凍結保存および再誘導を可能にするが、所望のゲノム変異8,9の生殖細胞系列キャリアを迅速にスクリーニング、同定、および単離するために利用することもできる。Brocalら(2016)は、F0を注入した雄ゼブラフィッシュ10において生殖細胞系列の編集をスクリーニングするためのシーケンシングベースの方法を以前に説明した。生殖細胞系列に存在する変異対立遺伝子を特定するのに有用ですが、このアプローチは高スループットではコストがかかる可能性があり、すべてのラボで利用できるとは限りません。対照的に、現在のプロトコルは、生殖細胞系列の編集を同定するための親しみやすく費用効果の高い電気泳動ベースの戦略を提供します。具体的には、このプロトコルは、高分解能アガロースゲル電気泳動を使用して、特定の遺伝子座で生殖細胞系列変異をスクリーニングおよび分離するための堅牢な方法を概説しています。さらに、このプロトコルは、特定の編集を含むドナーコンストラクトの統合の成功を識別するための同様の戦略を記述します。いつものように、特定の編集が必要な場合は、以下に説明するプロトコルと連携してシーケンスベースの戦略を実行できます。このプロトコルはゼブラフィッシュモデルシステムに固有ですが、これらの原則は、精子の収集が日常的な手順であるすべてのモデルに適応できる必要があります。これらの戦略を組み合わせることで、標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および/または制限消化後にゲル上で解決できる生殖細胞系列のインデル/編集を伴うF0注射された男性の同定が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、F0雄精子ゲノムに焦点を当てた分析により、CRISPR-Cas技術を使用して推定ゲノム編集または標的変異を迅速に特徴付ける方法を説明しています。このプロトコルは、安楽死なしで精子をサンプリングするために容易に利用できる他の動物モデルに適しているはずです。この方法は、目的の編集のスクリーニングのスループットを向上させ、まれなHDRを介したノックインイベ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ワシントン大学医学部のアンナ・ヒンデスがホットショット法を使用して高品質の精子ゲノムDNAを取得するための最初の努力に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の国立関節炎および筋骨格および皮膚疾患研究所から助成金を受けました(R01AR072009からR.S.G.)。
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
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| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
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| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
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| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
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| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
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| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
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