Virusförökning och cellbaserad kolorimetrisk kvantifiering
Summary
Detta protokoll beskriver spridningen av zikavirus (ZIKV) i njurceller från afrikanska gröna apor och kvantifieringen av ZIKV med hjälp av cellbaserade kolorimetriska immundetektionsmetoder i format med 24 brunnar och 96 brunnar (hög genomströmning).
Abstract
Zikavirus (ZIKV) är ett myggburet virus som tillhör släktet Flavivirus. ZIKV-infektion har associerats med medfödda hjärnabnormiteter och potentiellt Guillain-Barrés syndrom hos vuxna. Forskning om ZIKV för att förstå sjukdomsmekanismerna är viktig för att underlätta utveckling av vaccin och behandling. Metoden att kvantifiera virus är avgörande och grundläggande inom virologiområdet. Focus forming assay (FFA) är en viruskvantifieringsanalys som detekterar virusantigenet med antikroppar och identifierar infektionshärdarna hos celler med hjälp av peroxidasimmunfärgningstekniken. Den aktuella studien beskriver virusföröknings- och kvantifieringsprotokollet med hjälp av både 24-brunnars och 96-brunnars (hög genomströmning) format. Jämfört med andra liknande studier har detta protokoll ytterligare beskrivit optimering av foci size, vilket kan fungera som en guide för att utöka användningen av denna analys för andra virus. För det första utförs ZIKV-förökning i Vero-celler i 3 dagar. Kultursupernatanten som innehåller ZIKV skördas och kvantifieras med hjälp av FFA. Kortfattat inokuleras viruskulturen på Vero-celler och inkuberas i 2-3 dagar. Foci-bildning bestäms sedan efter optimerade färgningsprocesser, inklusive cellfixering, permeabilisering, blockering, antikroppsbindning och inkubation med peroxidassubstrat. De färgade virusfokusen visualiseras med hjälp av ett stereomikroskop (manuell räkning i 24-hålsformat) eller mjukvaruanalysator (automatiserad räkning i 96-hålsformat). FFA ger reproducerbara, relativt snabba resultat (3-4 dagar) och är lämplig att användas för olika virus, inklusive icke-plackbildande virus. Därefter är detta protokoll användbart för studier av ZIKV-infektion och kan användas för att upptäcka andra kliniskt viktiga virus.
Introduction
Zikavirusinfektion (ZIKV) är en växande myggburen virussjukdom. Den första isoleringen av ZIKV skedde i Uganda 1947 1,2; Det förblev försummat från 1947 till 2007, eftersom de kliniska symtomen oftast är asymtomatiska och kännetecknas av självbegränsande febersjukdom. År 2007 började zikaepidemin på Yapöarna 3,4, följt av större epidemier i Stillahavsregionerna (Franska Polynesien, Påskön, Cooköarna och Nya Kaledonien) från 2013 till 2014 5,6,7,8, där den allvarliga neurologiska komplikationen Guillain-Barrés syndrom (GBS) rapporterades hos vuxna för första gången9. Under 2015 och 2016 svepte den första utbredda ZIKV-epidemin över Nord- och Sydamerika efter uppkomsten av den asiatiska genotypen ZIKV i Brasilien så tidigt som 201310. Under detta utbrott rapporterades mellan 440 000 och 1,3 miljoner fall av mikrocefali och andra neurologiska sjukdomar hos nyföddabarn. Det finns för närvarande inget specifikt botemedel eller behandling för ZIKV-infektion. Det finns därför ett akut medicinskt behov av ZIKV-vacciner som kan förebygga infektioner, särskilt under graviditet.
Viruskvantifiering är en process för att bestämma antalet virus som finns i ett prov. Det spelar en viktig roll inom forskningen, och akademiska laboratorier involverar många områden, såsom medicin och biovetenskap. Denna process är också viktig inom kommersiella sektorer, såsom produktion av virala vacciner, rekombinanta proteiner, virala antigener eller antivirala medel. Många metoder eller analyser kan användas för kvantifieringav virus 12. Valet av metoder eller analyser beror normalt på virusets egenskaper, önskad noggrannhetsnivå och typen av experiment eller forskning. I allmänhet kan metoder för att kvantifiera virus delas in i två kategorier: molekylära analyser som detekterar närvaron av viral nukleinsyra (DNA eller RNA) och analyser som mäter virusets infektionsförmåga in vitro12. Kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR, för DNA) eller kvantitativ polymeraskedjereaktion med omvänd transkription (qRT-PCR, för RNA)13 och digital dropp-PCR14 är exempel på vanliga molekylära tekniker som används för att kvantifiera virusnukleinsyran i ett givet prov15. Dessa mycket känsliga molekylära tekniker kan dock inte skilja mellan livskraftiga och icke-livskraftiga virus15. Forskning som kräver information om biologiska egenskaper, t.ex. virusets smittsamhet på celler, kan därför inte slutföras med hjälp av de ovan nämnda molekylära teknikerna. Det behövs analyser som kan mäta och bestämma förekomsten av livskraftiga virus. Analyser som mäter virusets smittsamhet inkluderar plackbildande analys (PFA), 50 % vävnadskulturinfektionsdos (TCID50), fluorescerande fokusanalys och transmissionselektronmikroskopi (TEM)12.
PFA, som utvecklades av Renato Dulbecco 1952, är en av de mest använda metoderna för virustitrering, inklusive för ZIKV16. Det används för att direkt bestämma viruskoncentrationerna för infektiösa lytiska virioner. Metoden bygger på ett lytiskt virus förmåga att producera cytopatiska effekter (CPEs; zoner för celldöd eller plack, ett infektionsområde omgivet av oinfekterade celler) i ett inokulerat cellmonolager efter virusinfektion. Det finns dock flera nackdelar med analysen som påverkar dess användbarhet. Analysen är tidskrävande (tar cirka 7-10 dagar, beroende på virus), CPE-beroende och felbenägen. I den aktuella studien redovisar vi en immunokolorimetrisk teknik, focus forming assay (FFA), för att detektera och kvantifiera ZIKV i 24-brunnars plattformat och 96-håls plattformat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera analyser för att bestämma virustiter; PFA har ett liknande viruskvantifieringsprotokoll som FFA, där virusinokulet späds ut så att enskilda plack eller härdar kan urskiljas. Efter färgning indikerar varje plack eller fokus en enda infektiös partikel i inokulet19. PFA färgas med kristallviolett för att visualisera plackbildning orsakad av celllys eller död. Därför är PFA mer tidskrävande, eftersom det kräver längre tid för viruset att orsaka CPE, och det är endast…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning fick stöd från Malaysias ministerium för högre utbildning inom ramen för Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) och finansiering för programmet Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). Figur 3 i denna studie som visar arbetsflödet för färgning för den foci bildande analysen är anpassad från “DAB Immunohistochemistry” av BioRender.com (2022). Hämtad från https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
