ウイルス増殖と細胞ベースの比色定量
Summary
現在のプロトコルはVeroのアフリカの緑の猿の腎臓の細胞のジカウイルス(ZIKV)の伝播および24-wellおよび96-well(ハイスループット)フォーマットのセルベースの比色immunodetection方法を使用してZIKVの量化を記述する。
Abstract
ジカウイルス(ZIKV)は、 フラビウイルス属に属する蚊媒介ウイルスです。ZIKV感染は、成人の先天性脳異常およびギラン・バレー症候群の可能性と関連している。病気のメカニズムを理解するためのZIKVの研究は、ワクチンや治療法の開発を促進するために重要です。ウイルスを定量する方法は、ウイルス学の分野で重要かつ基本的です。焦点形成アッセイ(FFA)は、ペルオキシダーゼ免疫染色法を用いてウイルス抗原を抗体で検出し、細胞の感染病巣を同定するウイルス定量アッセイです。今回の研究では、24ウェルと96ウェル(ハイスループット)の両方のフォーマットを用いたウイルスの増殖および定量プロトコルについて説明しています。他の同様の研究と比較して、このプロトコルは、他のウイルスに対するこのアッセイの使用を拡大するためのガイドとして役立つ可能性のある焦点サイズの最適化をさらに説明しています。まず、ZIKVの増殖をVero細胞で3日間行います。ZIKVを含む培養上清を回収し、FFAを用いて定量します。簡単に説明すると、ウイルス培養物をVero細胞に接種し、2〜3日間インキュベートします。その後、細胞固定、透過処理、ブロッキング、抗体結合、ペルオキシダーゼ基質とのインキュベーションなど、最適化された染色プロセスを経て、病巣形成が決定されます。染色されたウイルス病巣は、実体顕微鏡(24ウェルフォーマットでの手動カウント)またはソフトウェアアナライザー(96ウェルフォーマットでの自動カウント)を使用して視覚化されます。FFAは、再現性のある比較的速い結果(3〜4日)を提供し、プラークを形成しないウイルスを含むさまざまなウイルスに使用するのに適しています。その後、このプロトコルはZIKV感染の研究に有用であり、他の臨床的に重要なウイルスの検出に使用できます。
Introduction
ジカウイルス(ZIKV)感染症は、蚊が媒介する新しいウイルス性疾患です。ZIKVの最初の孤立は1947年にウガンダで行われた1,2;1947年から2007年までは、臨床症状は無症候性であり、自己制限的な熱性疾患を特徴とするため、無視されたままでした。2007年、ジカ熱の流行はヤップ諸島で始まり3,4、続いて2013年から2014年にかけて太平洋地域(フランス領ポリネシア、イースター島、クック諸島、ニューカレドニア)でより大きな流行が続き5,6,7,8、重度の神経学的合併症であるギランバレー症候群(GBS)が初めて成人で報告されました9.2015年から2016年にかけて、早くも2013年にブラジルでZIKVのアジア遺伝子型が出現した後、最初の広範囲にわたるZIKVの流行が南北アメリカ大陸を席巻しました10。このアウトブレイクでは、新生児で44万〜130万件の小頭症やその他の神経障害が報告されました11。現在、ZIKV感染症の特定の治療法はありません。したがって、特に妊娠中の感染を予防できるZIKVワクチンの緊急の医学的必要性があります。
ウイルス定量は、サンプル中に存在するウイルスの数を決定するプロセスです。研究において重要な役割を担っており、学術研究所には医学や生命科学など多くの分野が関わっています。このプロセスは、ウイルスワクチン、組換えタンパク質、ウイルス抗原、抗ウイルス剤の製造などの商業分野でも重要です。ウイルスの定量には、多くの方法やアッセイを用いることができる12。方法やアッセイの選択は、通常、ウイルスの特性、望ましい精度のレベル、および実験や研究の性質によって異なります。一般に、ウイルスを定量する方法は、ウイルス核酸(DNAまたはRNA)の存在を検出する分子アッセイと、in vitroでウイルス感染性を測定するアッセイの2つのカテゴリーに分けることができます12。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR、DNA用)または定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR、RNA用)13およびデジタルドロップレットPCR14は、所与のサンプル中のウイルス核酸を定量するために使用される一般的な分子技術の例です15。しかし、これらの高感度の分子技術では、生存可能なウイルスと非生存可能なウイルスを区別することはできません15。そのため、細胞に対するウイルス感染力などの生物学的特徴に関する情報を必要とする研究は、上記の分子技術では完結できません。生存可能なウイルスの存在を測定および決定できるアッセイが必要です。ウイルスの感染性を測定するアッセイには、プラーク形成アッセイ(PFA)、50%組織培養感染線量(TCID50)、蛍光フォーカスアッセイ、透過型電子顕微鏡(TEM)などがあります12。
1952年にレナート・ダルベッコによって開発されたPFAは、ZIKV16を含むウイルス滴定に最も一般的に使用される方法の1つです。感染性溶解性ビリオンのウイルス濃度を直接測定するために使用されます。この方法は、溶解性ウイルスがウイルス感染後に接種された細胞単層に細胞変性効果(CPE、細胞死またはプラーク、感染していない細胞に囲まれた感染領域)を産生する能力に基づいています。しかし、このアッセイには、その有用性に影響を与えるいくつかの欠点があります。アッセイは時間がかかり(ウイルスにもよりますが、約7〜10日かかります)、CPEに依存し、エラーが発生しやすいです。本研究では、24ウェルプレートおよび96ウェルプレートフォーマットでZIKVを検出および定量するための免疫比色技術である焦点形成アッセイ(FFA)を報告します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ウイルス力価を決定するためのいくつかのアッセイがあります。PFAにはFFAと同様のウイルス定量プロトコルがあり、ウイルス接種物を希釈して個々のプラークまたは病巣を区別できるようにします。染色後、各プラークまたは病巣は、接種体19内の単一の感染性粒子を示す。PFAはクリスタルバイオレットで染色され、細胞溶解または細胞死によって引き起こされるプラーク?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、マレーシア高等教育省の長期研究助成制度(LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018)および高等教育機関センターオブエクセレンス(HICoE)プログラム(MO002-2019)の資金提供を受けました。本研究の図3は、BioRender.com(2022)の「DAB Immunohistochemistry」から引用した、病巣形成アッセイのための染色のワークフローを示しています。https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry から取得。
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
