वायरस प्रसार और सेल-आधारित वर्णमिति मात्रा का ठहराव
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल वेरो अफ्रीकी हरे बंदर गुर्दे की कोशिकाओं में जीका वायरस (ZIKV) के प्रसार और 24-अच्छी तरह से और 96-अच्छी तरह से (उच्च थ्रूपुट) प्रारूपों में सेल-आधारित वर्णमिति इम्यूनोडिटेक्शन विधियों का उपयोग करके ZIKV की मात्रा का वर्णन करता है।
Abstract
जीका वायरस (ZIKV) एक मच्छर जनित वायरस है जो जीनस फ्लेविवायरस से संबंधित है। ZIKV संक्रमण जन्मजात मस्तिष्क असामान्यताओं और वयस्कों में संभावित गुइलेन-बर्रे सिंड्रोम से जुड़ा हुआ है। रोग तंत्र को समझने के लिए ZIKV पर शोध वैक्सीन और उपचार के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। वायरोलॉजी के क्षेत्र में वायरस की मात्रा निर्धारित करने की विधि महत्वपूर्ण और मौलिक है। फोकस बनाने परख (एफएफए) एक वायरस मात्रा का ठहराव परख है जो एंटीबॉडी के साथ वायरल एंटीजन का पता लगाता है और पेरोक्सीडेज इम्यूनोस्टेनिंग तकनीक का उपयोग करके कोशिकाओं के संक्रमण की पहचान करता है। वर्तमान अध्ययन 24-अच्छी तरह से और 96-अच्छी तरह से (उच्च थ्रूपुट) दोनों प्रारूपों का उपयोग करके वायरस प्रसार और परिमाणीकरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इसी तरह के अन्य अध्ययनों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल ने आगे foci आकार अनुकूलन का वर्णन किया है, जो अन्य वायरस के लिए इस परख के उपयोग का विस्तार करने के लिए एक गाइड के रूप में काम कर सकता है। सबसे पहले, ZIKV प्रसार 3 दिनों के लिए वेरो कोशिकाओं में किया जाता है। ZIKV युक्त संस्कृति सतह पर तैरनेवाला काटा और FFA का उपयोग मात्रा निर्धारित की है. संक्षेप में, वायरस कल्चर को वेरो कोशिकाओं पर टीका लगाया जाता है और 2-3 दिनों के लिए ऊष्मायन किया जाता है। Foci गठन तो अनुकूलित धुंधला प्रक्रियाओं के बाद निर्धारित किया जाता है, सेल निर्धारण सहित, permeabilization, अवरुद्ध, एंटीबॉडी बाइंडिंग, और peroxidase सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेशन. सना हुआ वायरस foci एक स्टीरियो खुर्दबीन (24 अच्छी तरह से प्रारूप में मैनुअल गिनती) या सॉफ्टवेयर विश्लेषक (96 अच्छी तरह से प्रारूप में स्वचालित गिनती) का उपयोग कर कल्पना कर रहे हैं. एफएफए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, अपेक्षाकृत तेज़ परिणाम (3-4 दिन) प्रदान करता है और गैर-पट्टिका बनाने वाले वायरस सहित विभिन्न वायरस के लिए उपयोग करने के लिए उपयुक्त है। इसके बाद, यह प्रोटोकॉल ZIKV संक्रमण के अध्ययन के लिए उपयोगी है और इसका उपयोग अन्य नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण वायरस का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
जीका वायरस (ZIKV) संक्रमण एक उभरती हुई मच्छर जनित वायरल बीमारी है। ZIKV का पहला अलगाव 1947 1,2 में युगांडा में था; यह 1947 से 2007 तक उपेक्षित रहा, क्योंकि नैदानिक लक्षण सबसे अधिक स्पर्शोन्मुख होते हैं और आत्म-सीमित ज्वर की बीमारी की विशेषता होती है। 2007 में, जीका महामारी याप द्वीपों 3,4 में शुरू हुई, इसके बाद प्रशांत क्षेत्रों (फ्रेंच पोलिनेशिया, ईस्टर द्वीप, कुक आइलैंड्स और न्यू कैलेडोनिया) में 2013 से 2014 5,6,7,8 तक बड़ी महामारी हुई, जहांपहली बार वयस्कों में गंभीर न्यूरोलॉजिकल जटिलता गुइलेन-बैरे सिंड्रोम (जीबीएस) की सूचना मिली थी 9. 2015 और 2016 के दौरान, 2013-10 की शुरुआत में ब्राजील में ZIKV के एशियाई जीनोटाइप के उद्भव के बाद अमेरिका भर में पहली व्यापक ZIKV महामारी बह गई। इस प्रकोप के दौरान, नवजात शिशुओंमें माइक्रोसेफली और अन्य न्यूरोलॉजिकल विकारों के 440,000 से 1.3 मिलियन मामले सामने आए। वर्तमान में ZIKV संक्रमण के लिए कोई विशिष्ट इलाज या उपचार नहीं है; इसलिए, संक्रमण को रोकने में सक्षम ZIKV टीकों की तत्काल चिकित्सा आवश्यकता है, खासकर गर्भावस्था के दौरान।
वायरस की मात्रा का ठहराव एक नमूने में मौजूद वायरस की संख्या निर्धारित करने की एक प्रक्रिया है। यह अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और अकादमिक प्रयोगशालाओं में कई क्षेत्र शामिल हैं, जैसे कि चिकित्सा और जीवन विज्ञान। यह प्रक्रिया वाणिज्यिक क्षेत्रों में भी महत्वपूर्ण है, जैसे वायरल टीके, पुनः संयोजक प्रोटीन, वायरल एंटीजन या एंटीवायरल एजेंटों का उत्पादन। कई तरीकों या assays वायरस quantification12 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विधियों या परख का चुनाव सामान्य रूप से वायरस की विशेषताओं, सटीकता के वांछित स्तर और प्रयोग या अनुसंधान की प्रकृति पर निर्भर करता है। सामान्य तौर पर, वायरस की मात्रा निर्धारित करने के तरीकों को दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: आणविक परख जो वायरल न्यूक्लिक एसिड (डीएनए या आरएनए) की उपस्थिति का पता लगाते हैं और परख जो इन विट्रो12 में वायरस संक्रामकता को मापते हैं। मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर, डीएनए के लिए) या मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर, आरएनए के लिए)13 और डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर14 किसी दिए गए नमूने15 में वायरल न्यूक्लिक एसिड की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सामान्य आणविक तकनीकों के उदाहरण हैं। हालांकि, इन अत्यधिक संवेदनशील आणविक तकनीक व्यवहार्य और गैर व्यवहार्य वायरस15 के बीच अंतर नहीं कर सकते. इसलिए, अनुसंधान जिसके लिए जैविक विशेषताओं के बारे में जानकारी की आवश्यकता होती है, जैसे कि कोशिकाओं पर वायरस संक्रामकता, उपर्युक्त आणविक तकनीकों का उपयोग करके पूरा नहीं किया जा सकता है; परख जो व्यवहार्य वायरस की उपस्थिति को माप और निर्धारित कर सकते हैं, की आवश्यकता है। परख है कि उपाय वायरस संक्रामकता परख बनाने पट्टिका (पीएफए), 50% ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID50), फ्लोरोसेंट फोकस परख, और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)12 शामिल हैं.
1952 में रेनाटो डुलबेको द्वारा विकसित पीएफए, वायरस अनुमापन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधियों में से एक है, जिसमें ZIKV16 भी शामिल है। इसका उपयोग संक्रामक लिटिक विषाणुओं के लिए वायरल सांद्रता को सीधे निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यह विधि वायरल संक्रमण के बाद एक टीका कोशिका मोनोलेयर में साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई; कोशिका मृत्यु या सजीले टुकड़े के क्षेत्र, असंक्रमित कोशिकाओं से घिरे संक्रमण का एक क्षेत्र) उत्पन्न करने के लिए एक लिटिक वायरस की क्षमता पर आधारित है। हालांकि, परख में कई कमियां हैं जो इसकी उपयोगिता को प्रभावित करती हैं। परख समय लेने वाली है (वायरस के आधार पर लगभग 7-10 दिन लगते हैं), सीपीई-निर्भर, और त्रुटियों के लिए प्रवण। वर्तमान अध्ययन में, हम 24-वेल प्लेट और 96-वेल प्लेट प्रारूपों में ZIKV का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक इम्यूनोकोरिमेट्रिक तकनीक, फोकस फॉर्मिंग परख (FFA) की रिपोर्ट करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वायरस टिटर निर्धारित करने के लिए कई परख हैं; पीएफए में एफएफए के समान वायरस क्वांटिटेशन प्रोटोकॉल है, जिसमें वायरस इनोकुलम को अलग-अलग सजीले टुकड़े या foci को प्रतिष्ठित करने की अनुमति देने के लिए पतला किया…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को दीर्घकालिक अनुसंधान अनुदान योजना (LRGS MRUN चरण 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) के तहत उच्च शिक्षा मंत्रालय मलेशिया से समर्थन प्राप्त हुआ और उच्च संस्थान उत्कृष्टता केंद्र (HICoE) कार्यक्रम (MO002-2019) के लिए वित्त पोषण हुआ। इस अध्ययन में चित्रा 3 जो foci बनाने की परख के लिए धुंधला होने के वर्कफ़्लो को दिखाता है, BioRender.com (2022) द्वारा “डीएबी इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री” से अनुकूलित किया गया है। https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry से लिया गया।
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
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