Propagation des virus et quantification colorimétrique cellulaire
Summary
Le présent protocole décrit la propagation du virus Zika (ZIKV) dans les cellules rénales de singes verts d’Afrique et la quantification du virus Zika à l’aide de méthodes d’immunodétection colorimétrique cellulaires dans des formats à 24 puits et 96 puits (haut débit).
Abstract
Le virus Zika (ZIKV) est un virus transmis par les moustiques appartenant au genre Flavivirus. L’infection par le virus Zika a été associée à des anomalies cérébrales congénitales et potentiellement au syndrome de Guillain-Barré chez l’adulte. La recherche sur le virus Zika pour comprendre les mécanismes de la maladie est importante pour faciliter la mise au point d’un vaccin et d’un traitement. La méthode de quantification des virus est cruciale et fondamentale dans le domaine de la virologie. Le test de formation de foyer (FFA) est un test de quantification virale qui détecte l’antigène viral avec des anticorps et identifie les foyers d’infection des cellules à l’aide de la technique d’immunomarquage de la peroxydase. La présente étude décrit le protocole de propagation et de quantification du virus à l’aide de formats à 24 puits et à 96 puits (haut débit). Comparé à d’autres études similaires, ce protocole a décrit plus en détail l’optimisation de la taille des foyers, ce qui peut servir de guide pour étendre l’utilisation de ce test à d’autres virus. Tout d’abord, la propagation du ZIKV est effectuée dans les cellules Vero pendant 3 jours. Le surnageant de culture contenant le virus Zika est récolté et quantifié à l’aide de l’AGL. Brièvement, la culture virale est inoculée sur les cellules Vero et incubée pendant 2 à 3 jours. La formation des foyers est ensuite déterminée après des processus de coloration optimisés, y compris la fixation cellulaire, la perméabilisation, le blocage, la liaison aux anticorps et l’incubation avec un substrat de peroxydase. Les foyers de virus colorés sont visualisés à l’aide d’un stéréomicroscope (comptage manuel au format 24 puits) ou d’un analyseur logiciel (comptage automatisé au format 96 puits). Le FFA fournit des résultats reproductibles et relativement rapides (3-4 jours) et peut être utilisé pour différents virus, y compris les virus non plaques. Par la suite, ce protocole est utile pour l’étude de l’infection par le virus Zika et pourrait être utilisé pour détecter d’autres virus cliniquement importants.
Introduction
L’infection par le virus Zika (ZIKV) est une maladie virale émergente transmise par les moustiques. Le premier isolement du virus Zika a eu lieu en Ouganda en 1947 1,2 ; Elle est restée négligée de 1947 à 2007, car les symptômes cliniques sont le plus souvent asymptomatiques et caractérisés par une maladie fébrile spontanément résolutive. En 2007, l’épidémie de Zika a commencé dans les îles Yap 3,4, suivie d’épidémies plus importantes dans les régions du Pacifique (Polynésie française, île de Pâques, îles Cook et Nouvelle-Calédonie) de 2013 à 2014 5,6,7,8, où la complication neurologique sévère du syndrome de Guillain-Barré (SGB) a été signalée chez l’adulte pour la première fois 9. En 2015 et 2016, la première épidémie généralisée de virus Zika a balayé les Amériques après l’émergence du génotype asiatique du virus Zika au Brésil dès 201310. Au cours de cette épidémie, 440 000 à 1,3 million de cas de microcéphalie et d’autres troubles neurologiques ont été signalés chez les nouveau-nés11. À l’heure actuelle, il n’existe pas de remède ou de traitement spécifique pour l’infection par le virus Zika ; Il existe donc un besoin médical urgent de vaccins contre le virus Zika capables de prévenir les infections, en particulier pendant la grossesse.
La quantification virale est un processus permettant de déterminer le nombre de virus présents dans un échantillon. Il joue un rôle important dans la recherche, et les laboratoires académiques impliquent de nombreux domaines, tels que la médecine et les sciences de la vie. Ce processus est également important dans les secteurs commerciaux, tels que la production de vaccins viraux, de protéines recombinantes, d’antigènes viraux ou d’agents antiviraux. De nombreuses méthodes ou tests peuvent être utilisés pour la quantification du virus12. Le choix des méthodes ou des essais dépend normalement des caractéristiques du virus, du niveau de précision souhaité et de la nature de l’expérience ou de la recherche. En général, les méthodes de quantification des virus peuvent être divisées en deux catégories : les tests moléculaires qui détectent la présence d’acide nucléique viral (ADN ou ARN) et les tests qui mesurent l’infectivité virale in vitro12. La réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR, pour l’ADN) ou la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR, pour l’ARN)13 et la PCR par gouttelettes numériques14 sont des exemples de techniques moléculaires couramment utilisées pour quantifier l’acide nucléique viral dans un échantillon donné15. Cependant, ces techniques moléculaires très sensibles ne permettent pas de faire la différence entre les virus viables et non viables15. Par conséquent, les recherches qui nécessitent des informations sur les caractéristiques biologiques, telles que l’infectivité du virus sur les cellules, ne peuvent pas être menées à bien à l’aide des techniques moléculaires susmentionnées ; Des tests permettant de mesurer et de déterminer la présence de virus viables sont nécessaires. Les tests qui mesurent l’infectivité du virus comprennent le test de formation de plaque (PFA), la dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50), le test de focalisation fluorescente et la microscopie électronique à transmission (MET)12.
Le PFA, mis au point par Renato Dulbecco en 1952, est l’une des méthodes les plus couramment utilisées pour le titrage du virus, y compris pour le virus Zika16. Il est utilisé pour déterminer directement les concentrations virales des virions lytiques infectieux. La méthode est basée sur la capacité d’un virus lytique à produire des effets cytopathiques (CPEs, zones de mort cellulaire ou plaques, zone d’infection entourée de cellules non infectées) dans une monocouche cellulaire inoculée après une infection virale. Cependant, le test présente plusieurs inconvénients qui affectent son utilité. Le test prend du temps (environ 7 à 10 jours, selon les virus), dépend du CPE et est sujet aux erreurs. Dans la présente étude, nous rapportons une technique immunocolorimétrique, le test de formation de foyer (FFA), pour la détection et la quantification du virus Zika dans des formats de plaques à 24 puits et de plaques à 96 puits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe plusieurs tests pour déterminer le titre du virus ; le PFA a un protocole de quantification du virus similaire à celui du FFA, dans lequel l’inoculum du virus est dilué pour permettre de distinguer les plaques ou les foyers individuels. Après coloration, chaque plaque ou foyer indique une seule particule infectieuse dans l’inoculum19. Le PFA est coloré avec du violet cristallin pour visualiser la formation de plaque causée par la lyse cellulaire ou la mort. Par conséquent, le…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a reçu le soutien du ministère de l’Enseignement supérieur de Malaisie dans le cadre du programme de subventions de recherche à long terme (LRGS MRUN Phase 1 : LRGS MRUN/F1/01/2018) et un financement du programme Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). La figure 3 de cette étude qui montre le flux de travail de coloration pour le test de formation des foyers est adaptée de « DAB Immunohistochemistry » par BioRender.com (2022). Récupéré de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
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