In vivo Исследование в режиме реального времени влияния препарата на сонный кровоток у овечьего плода
Summary
В настоящем протоколе описан способ периваскулярной доставки лекарственных препаратов и агентов, модифицирующих экспрессию генов, внутриутробно развивающемуся плоду. Важно отметить, что влияние лекарств/агентов на кровоток можно измерить по мере прогрессирования беременности.
Abstract
Способность организма поддерживать постоянный приток крови к мозгу в ответ на внезапные скачки системного артериального давления (АД) известна как церебральная ауторегуляция (CAR), которая происходит в сонной артерии. В отличие от доношенных новорожденных, недоношенные новорожденные не способны снижать мозговой кровоток (КБК) в ответ на повышение системного АД. У недоношенных новорожденных это подвергает хрупкие сосуды головного мозга высокому перфузионному давлению, что приводит к их разрыву и повреждению мозга. Исследования ex vivo с использованием проволочной миографии продемонстрировали, что сонные артерии недоношенного плода сужаются в ответ на активацию адренергических альфа1-рецепторов. Эта реакция притупляется у недоношенного плода. Таким образом, для изучения роли альфа1-АР in vivo представлен инновационный подход к определению влияния лекарственных препаратов на сегмент сонной артерии in vivo у овцевидного плода в период развития гестации. Представленные данные свидетельствуют об одновременном измерении внутриутробного кровотока плода и артериального давления. Периваскулярная система доставки может быть использована для проведения длительного исследования в течение нескольких дней. Дополнительные применения этого метода могут включать системы доставки вируса для изменения экспрессии генов в сегменте сонной артерии. Эти методы могут быть применены к другим кровеносным сосудам в растущем организме внутриутробно , а также во взрослом организме.
Introduction
Рождение вызывает стресс у плода, и происходит значительное повышение уровня катехоламина, основного гормона стресса 1,2. Это повышает системное АД, и если это давление передается в хрупкие капилляры головного мозга через сонные артерии, это может привести к их разрыву 3,4,5. Скачки системного АД не достигают головного мозга из-за сужения сонных артерий у доношенного плода. Однако этот механизм не развит у недоношенного плода, и это ответственно за значительно более высокую вероятность поражения головного мозга у недоношенных плодов 4,5.
В настоящее время не существует подходящего метода для изучения созревания путей, участвующих в регуляции сонного кровотока у развивающихся плодов. Эти исследования сонного кровотока и вазочувствительности имеют решающее значение как с фундаментальной научной, так и с клинической точки зрения. В настоящее время для определения молекулярных путей, участвующих в регуляции сократимости артерий, стандартный метод предполагает посмертную изоляцию артериальных сегментов. Затем проводятся эксперименты с использованием проволочной миографии для определения вазосократимости различных фармакологических молекул, определяющих регуляторные пути, участвующие в артериальной сократимости 6,7. Следует отметить, что результаты ex vivo не способны полностью воспроизвести среду in vivo из-за регуляции кровотока вверх и вниз по течению от сонной артерии. Таким образом, целью настоящего исследования была разработка методики, позволяющей определять влияние вазочувствительных химических веществ или агентов на кровоток в артерии in vivo.
Методология периваскулярной доставки, описанная в данной статье, обеспечивает подход in vivo для изучения влияния фармакологических или генетических манипуляций сигнальных путей на различные артериальные сегменты. С помощью этого метода можно манипулировать артериальным давлением плода и сонным кровотоком. Кроме того, демонстрируются эксперименты с зародышами овец для изучения эффектов сигнальных молекул в развивающемся плоде. Будем надеяться, что представленная подробная методология приведет к новым исследованиям в области изучения кровотока, особенно в отношении физиологии и патологии плода.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящее время не существует метода изучения сократимости и дилатации сосудов in vivo в ответ на лекарственные соединения и манипуляции с генами. В качестве стандарта в этой области кровоток in vivo измеряется с помощью допплеровских датчиков, микросфер и радиоактивных молекул,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Для этих исследований были использованы внутренние средства Университета Аризоны.
Materials
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A. The "stress" of being born. Scientific American. 254 (4), 100-107 (1986).
- Ronca, A. E., Abel, R. A., Ronan, P. J., Renner, K. J., Alberts, J. R. Effects of labor contractions on catecholamine release and breathing frequency in newborn rats. Behavioral Neuroscience. 120 (6), 1308-1314 (2006).
- Czynski, A., et al. Cerebral autoregulation is minimally influenced by the superior cervical ganglion in two- week-old lambs, and absent in preterm lambs immediately following delivery. PLoS One. 8 (12), e82326 (2013).
- Ballabh, P. Pathogenesis and prevention of intraventricular hemorrhage. Clinics in Perinatology. 41 (1), 47-67 (2014).
- Ballabh, P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: Mechanism of disease. Pediatric Research. 67 (1), 1-8 (2010).
- Goyal, R., Goyal, D., Chu, N., Van Wickle, J., Longo, L. Cerebral artery alpha-1 AR subtypes: High altitude long-term acclimatization responses. PLoS One. 9 (11), e112784 (2014).
- Goyal, R., Mittal, A., Chu, N., Zhang, L., Longo, L. D. alpha(1)-Adrenergic receptor subtype function in fetal and adult cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (1), H1797-H1806 (2010).
- Goyal, D., Goyal, R. Developmental maturation and alpha-1 adrenergic receptors-mediated gene expression changes in ovine middle cerebral arteries. Scientific Reports. 8 (1), 1772 (2018).
- Goyal, R., et al. Maturation and the role of PKC-mediated contractility in ovine cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 297 (6), H2242-H2252 (2009).
- Gratton, R., Carmichael, L., Homan, J., Richardson, B. Carotid arterial blood flow in the ovine fetus as a continuous measure of cerebral blood flow. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 3 (2), 60-65 (1996).
- Bishai, J. M., Blood, A. B., Hunter, C. J., Longo, L. D., Power, G. G. Fetal lamb cerebral blood flow (CBF) and oxygen tensions during hypoxia: a comparison of laser Doppler and microsphere measurements of CBF. Journal of Physiology. 546, 869-878 (2003).
- Ashwal, S., Dale, P. S., Longo, L. D. Regional cerebral blood flow: studies in the fetal lamb during hypoxia, hypercapnia, acidosis, and hypotension). Pediatric Research. 18 (12), 1309-1316 (1984).
