Популяционный и одноклеточный анализ персистенции антибиотиков при Escherichia coli

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильную стеклянную посуду для культур, наконечники пипеток и питательную среду. Здесь клетки E. coli выращивали в химически определенной среде с низкой автофлуоресценцией (см. Таблицу материалов). Инокуляции проводились в присутствии горелки Бунзена, чтобы свести к минимуму риск загрязнения. 1. Клеточная культура и кривая роста Нанесите интересующий штамм из замороженного глицерина на агаровую пластину Лурия-Бертайни (LB) (при необходимости с добавлением селективного антибиотика) и инкубируйте при 37 ° C в течение ночи (от 15 до 19 часов) для получения единичных колоний.ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном здесь эксперименте используются два штамма: E. coli K-12 MG1655, соответствующий штамму wt, и изогенный штамм MG1655 hupA-mCherry 22. Последний штамм экспрессирует меченную флуоресценцией α-субъединицу нуклеоид-ассоциированного белка HU. Репортер hupA-mCherry интегрирован в родной локус hupA. HU-mCherry служит прокси для отслеживания динамики нуклеоидов в живых клетках, поскольку он связывается с ДНК неспецифическим образом. Инокулируют 5 мл среды (в данном случае 3-[N-морфолино] среды на основе пропансульфоновой кислоты [MOPS]; Таблица 1, Таблица 2 и Таблица 3) дополняют глюкозой 0,4% и селективным антибиотиком (при необходимости) с изолированной колонией в стеклянной пробирке (≥25 мл) и помещают пробирку в встряхивающий инкубатор с температурой 37 ° C и 180 оборотами в минуту (об/мин) на ночь (от 15 до 19 часов). В качестве альтернативы вместо стеклянных трубок можно использовать пластиковые трубки, стекло или пластиковые колбы (≥ 25 мл).ПРИМЕЧАНИЕ: Среда MOPS с добавлением глицерина в конечной концентрации 0,4% использовалась во всех экспериментах, описанных в этой статье, за исключением ночных культур, которые проводились в MOPS глюкозы 0,4%. Время генерации кишечной палочки в MOPS с добавлением глюкозы короче, чем в глицерине MOPS. Использование MOPS глюкозы 0,4% вместо MOPS глицерина 0,4% на этом этапе гарантирует, что клетки достигнут стационарной фазы в течение 19 часов. Также можно использовать другие питательные среды, такие как M9 или богатая определенная среда (RDM), дополненная различными источниками углерода. Следует, однако, отметить, что скорость роста и частота стойкости различны в зависимости от используемой среды и/или углерода23. На следующее утро центрифугу 1 мл культуры в 2,300 x g в течение 3 мин, выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулу в том же объеме фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD 600 нм) и рассчитайте объем, необходимый для начального OD600 нм 0,01 в конечном объеме 2 мл. Поместите 2 мл 0,4% среды глицерина MOPS в лунку с чистым дном 24-луночной пластины и инокулируйте рассчитанным объемом культуры за ночь. Поместите 24-луночную пластину в автоматический считыватель микропланшетов (см. Таблицу материалов) для контроля наружного диаметра600 нм в течение 24 часов. Установите считыватель микропланшетов на измерение OD600 нм каждые 15 минут при температуре 37 °C и при высоком вращении орбиты (140 об/мин).ПРИМЕЧАНИЕ: Если штамм, используемый в эксперименте, кодирует флуоресцентный репортер, убедитесь, что его скорость роста сопоставима с частотой роста , чтобы избежать каких-либо артефактов в последующих экспериментах, поскольку скорость роста влияет на частоту персистенции антибиотиков23. Из-за ограничений обнаружения при очень низких плотностях клеток и потенциального штаммоспецифического влияния на соотношение OD600 нм/колониеобразующих единиц (КОЕ) рекомендуется оценивать кинетику роста путем мониторинга КОЕ·мл-1 при работе с неохарактеризованными штаммами. 2. Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) определяется как самая низкая доза антибиотика, при которой не наблюдается роста бактерий. Определение МПК необходимо проводить для каждого антибиотика и штамма. В описанных здесь экспериментах использовался фторхинолоновый антибиотик офлоксацин (OFX). Определение МПК позволяет подтвердить, что раствор антибиотика приготовлен правильно, антибиотик активен, а штаммы одинаково чувствительны к антибиотику. Здесь был выполнен опубликованный метод разбавления агара для определения MIC к OFX различных используемых штаммов24. МПК данного антибиотика к данному бактериальному штамму также может быть определен с помощью метода24 разведения бульона. Подготовка пластин для определения МПКПриготовьте основной раствор для антибиотика, используемого в экспериментах, растворив 5 мг OFX в 1 мл сверхчистой воды. Добавьте 20 мкл 37% HCl для увеличения растворимости OFX. Растопите 100 мл стерильного агара LB и храните его при температуре 55 °C, чтобы избежать затвердевания. Подготовьте шесть маленьких стеклянных колб (25 мл) и запипейте 5 мл жидкой агаровой среды LB в каждую колбу с помощью стерильной пипетки. Разведите 10 мкл основного раствора OFX объемом 5 мг·мл-1 в 90 мкл сверхчистой воды (разведение основного сырья 1:10). Добавьте 0 мкл, 2 мкл, 4 мкл, 6 мкл, 8 мкл или 10 мкл раствора OFX 500 мкг·мл-1 в каждую из шести стеклянных колб, содержащих 5 мл агаровой среды LB, чтобы получить среду LB-агара с конечными концентрациями 0 мкг·мл-1, 0,02 мкг·мл-1, 0,04 мкг·мл-1, 0,04 мкг·мл-1, 0,06 мкг·мл-1, 0,08 мкг·мл−1 и 0,1 мкг·мл-1 OFX соответственно. Перемешайте раствор, повернув колбы несколько раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Если МПК интересующего антибиотика известен, диапазон концентраций должен достигать от нижнего до верхнего фактического МИК. Если МПК неизвестен, рекомендуется большой диапазон концентраций с серией разведения log2 . Перед добавлением антибиотика убедитесь, что агаровая среда LB остыла, так как высокие температуры могут ее инактивировать. Тем не менее, важно не допускать затвердевания агаровой среды LB перед добавлением антибиотика, так как это может привести к неоднородному распределению антибиотика в агаровой среде LB. Вылейте по 5 мл каждой из шести агаровых сред LB, приготовленных на этапе 2.1.3, с увеличением дозы в 6-луночную культуральную пластину с помощью стерильной пипетки. Дайте агару остыть до застывания и высушите тарелку перед использованием.ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор антибиотика и культуральную пластину в день проведения анализа. Анализ определения МПКИнокулируют 5 мл среды LB изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и помещают стеклянную пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 ° C и 180 об/мин на ночь (от 15 до 19 часов). На следующее утро измерьте OD600 нм и разбавьте культуру в пробирке до конечной плотности клеток 1 x 107 КОЕ · мл -1 в PBS. Для штаммов, протестированных здесь, 1 x 107 КОЕ·мл-1 соответствует OD600 нм 0,0125.ПРИМЕЧАНИЕ: Если корреляция между КОЕ·мл-1 и OD 600 нм неизвестна, следует установить кривую роста, определенную измерениями КОЕ и OD 600 нм, для расчета коэффициента корреляции между КОЕ·мл-1 и OD 600 нм. Нанесите 2 мкл предварительно разбавленной культуры на каждую лунку высушенной 6-луночной пластины. Дайте пятнам высохнуть, прежде чем помещать тарелку в инкубатор при температуре 37 ° C на ночь (от 15 до 19 часов). На следующий день посчитайте колонии, образовавшиеся в каждой лунке. МПК соответствует лунке с минимальной концентрацией антибиотика, в которой не обнаружен рост бактерий. 3. Точечный анализ ПРИМЕЧАНИЕ: Метод точечного анализа является качественным подходом, который позволяет оценить количество жизнеспособных клеток (клеток, способных генерировать колонии после антибиотикового стресса). Точечный анализ проводится перед анализом с временным уничтожением, чтобы дать представление о жизнеспособности штамма, используемого в тестируемых условиях, и сообщить о разведениях, необходимых во время анализа с замедленным уничтожением (см. Раздел 4). Чтобы подготовить агаровые пластины LB для точечных анализов, налейте 50 мл агара LB в квадратную чашку Петри (144 см2 ). Подготовьте одну квадратную чашку Петри за каждый момент времени. Дайте агару LB затвердеть и высушите пластины перед использованием. Инокулируют 5 мл среды (MOPS глюкозы 0,4%) изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и помещают пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 ° C и 180 об/мин на ночь (от 15 до 19 часов). На следующий день измерьте OD 600 нм и разбавьте культуру в свежей среде с регулируемой температурой (37 °C, глицерин MOPS 0,4%) в стеклянной пробирке (≥25 мл) до конечного OD600 нм ~ 0,001. Дайте культуре вырасти в течение ночи в инкубаторе при 37 ° C при 180 об/мин (от 15 до 19 часов). На следующий день измерьте OD 600 нм и инкубируйте культуру до конечного OD600 нм 0,3. Во время инкубации готовят 96-луночные планшеты, помещая 90 мкл 0,01 М раствора MgSO4 в каждую лунку, кроме лунок первого ряда (ряд А). 96-луночные пластины будут использоваться для 10-кратного последовательного разбавления на этапе 3.7.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте два штамма (wt и штамм hupA-mCherry ) были протестированы в трех экземплярах в семи разных временных точках. Поскольку одна пластина состоит из 12 колонн, одна пластина может быть использована в течение двух временных точек, и, таким образом, всего было подготовлено четыре пластины. При OD600 нм 0,3 извлеките 200 мкл каждой бактериальной культуры. Эти образцы соответствуют t0 (необработанному) моменту времени до лечения антибиотиками и позволяют определить КОЕ·мл-1 до лечения антибиотиками. Центрифугируют образцы при 2 300 x g в течение 3 мин. Во время центрифугирования добавьте желаемую концентрацию OFX в жидкую культуру и продолжайте инкубацию при 37 ° C при встряхивании.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь OFX использовался в концентрации 5 мкг·мл-1 (что соответствует МПК, умноженному в 83 раза). В предыдущем исследовании эта концентрация использовалась для характеристики явления персистенции при воздействии OFX25. Концентрация антибиотика, используемая для анализов времени/уничтожения, может варьироваться в зависимости от антибиотика, питательной среды и состояния роста бактерий. После центрифугирования ресуспендируют гранулу ячейки в 200 мкл раствора 0,01 М MgSO4 . Поместите 100 мкл в пустую лунку 96-луночной пластины, подготовленной на шаге 3.5. Проведите разбавление, перелив 10 мкл из скважины в ряду А в скважину в ряду В, содержащую 90 мкл 0,01 М MgSO4. Продолжайте последовательные разведения, перенося 10 мкл из скважины в ряду B в скважину в ряду C. Повторяйте до тех пор, пока не достигнете разбавления 10-7 (при этом каждая пересадка представляет собой 10-кратное разбавление).ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте шесть культур (три для штамма wt и три для штамма hupA-mCherry ) были протестированы для каждого момента времени. Согласно протоколу, многоканальная пипетка используется для выполнения последовательных разведений для шести штаммов одновременно. Чтобы свести к минимуму техническую ошибку, наконечники дозатора меняются между каждой передачей. Нанесите 10 мкл каждого разбавления на пластины с агаром LB, приготовленные на этапе 3.1.ПРИМЕЧАНИЕ: Многоканальная пипетка используется для одновременного определения одного и того же разведения (например, разведения 10−4 ) для шести культур. Во время кровянистого выделения следует использовать первую стопу многоканальной пипетки, не нажимая на вторую стопу, так как это может привести к выдаче микрокапель на пластину. В соответствующие моменты времени после добавления антибиотика извлеките 200 мкл культуры и выполните последовательные разведения, как описано на шаге 3.8. Выделите 10 мкл каждого разведения, как описано на этапе 3.9.ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента, описанного здесь, было собрано семь временных точек (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Для штаммов, проявляющих повышенную чувствительность к антибиотикам по сравнению с массой, можно проводить многократные промывки в MgSO4 0,01 М для удаления остаточных антибиотиков. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи (от 15 до 19 часов). На следующий день подсчитайте количество колоний в двух самых высоких разведениях, для которых могут быть обнаружены колонии. В идеале пятна на агаровых пластинах для этих разведений содержат от 3 до 30 колоний, что позволяет точно определить КОЕ·мл-1 для каждого образца. Рассчитайте коэффициент выживаемости, разделив рассчитанный КОЕ · мл -1 каждого момента времени на КОЕ · мл -1 исходной популяции при t0. 4. Анализы замедленного действия ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как точечные анализы являются простым в использовании методом оценки выживаемости данного штамма для данного антибиотика, анализы с временным уничтожением дают выживаемость с более высоким разрешением и выполняются для точной количественной оценки жизнеспособности бактерий. Профиль кривой убийства может быть использован для определения того, является ли данный бактериальный штамм чувствительным, толерантным или устойчивым к антибиотику в данном состоянии. Кроме того, анализы с временным уничтожением позволяют определить время воздействия антибиотиков, необходимое для выявления явления персистенции (начало второго наклона двухфазной кривой уничтожения), а также частоту персистенции. Подготовьте агаровые пластины LB для анализа с замедленным покрытием. Налейте 25 мл агара LB в чашку Петри (±57 см2 ). Приготовьте не менее двух чашек Петри за каждый момент времени (два разведения на определенный момент времени на штамм). Дайте агару LB затвердеть и высушите пластины, прежде чем добавлять пять-восемь стерильных стеклянных шариков в каждую тарелку. Переверните и пометьте пластины в соответствии с деформацией/состоянием/моментом времени.ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные шарики позволяют распространять бактерии на агаровых пластинах на этапах 4.7 и 4.9. В качестве альтернативы, клетки могут быть диспергированы на агаровой пластине с помощью разбрасывателя. Для каждого образца готовят стеклянные пробирки с последовательным разбавлением в 10 раз, содержащие 900 мкл 0,01 М раствора MgSO4 . Количество стеклянных пробирок для разбавления на образец, который необходимо подготовить, соответствует разведениям, необходимым для обнаружения колоний в точечном анализе. Инокулируют 5 мл среды (MOPS глюкозы 0,4%) изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и помещают пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 ° C и 180 об/мин на ночь (от 15 до 19 часов). После 16 ч роста измерьте OD 600 нм и разбавьте культуру в свежей среде с регулируемой температурой (37 °C, глицерин MOPS 0,4%) в стеклянной трубке до конечного OD600 нм ~0,001 . Дайте культуре вырасти в течение ночи в инкубаторе при 37 ° C при 180 об/мин (от 15 до 19 часов). На следующий день измерьте OD 600 нм и инкубируйте культуру до конечного OD600 нм 0,3. При OD 600 нм 0,3 извлеките 100 мкл культуры, разбавьте в соответствии с данными, полученными в точечном анализе (при OD600 нм 0,3 и без антибиотика разведение 10−5 обычно дает 200-300 колоний), и планшет100 мкл на агаровых планшетах LB, приготовленных на этапах 4.1-4.2. Осторожно встряхните тарелки, чтобы шарики не соприкасались с краями блюда, так как это может привести к неоднородному распространению бактериальных клеток на агаровой среде LB. Этот первый образец перед лечением антибиотиками соответствует моменту времени t0 (КОЕ · мл -1 до лечения антибиотиками). Добавьте желаемую концентрацию OFX и продолжайте инкубацию при 37 ° C, встряхивая.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь OFX использовался в концентрации 5 мкг·мл-1 (что соответствует МПК, умноженному в 83 раза). В соответствующие моменты времени после добавления антибиотика извлеките 100 мкл культуры, разведите в соответствии с данными, полученными в точечном анализе, и планшет 100 мкл на планшетах с агаром LB, приготовленных на этапах 4.1-4.2. Распределите ячейки, как описано в шаге 4.7.ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента, описанного здесь, было собрано семь временных точек (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Для штаммов, проявляющих повышенную чувствительность к антибиотикам по сравнению с массой, можно проводить многократные промывки в MgSO4 0,01 М для удаления остаточных антибиотиков. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи (от 15 до 19 часов). На следующий день подсчитайте количество колоний в двух самых высоких разведениях, для которых могут быть обнаружены колонии. В идеале планшеты должны содержать 30-300 колоний, чтобы обеспечить точное определение КОЕ·мл-1 в каждом образце. Рассчитайте коэффициент выживаемости, нормализуя КОЕ · мл -1 в каждый момент времени на КОЕ · мл -1 при t0. Постройте логарифмическое10 нормализованное КОЕ·мл-1 в зависимости от времени. 5. Микрофлюидная покадровая микроскопия ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе описывается подготовка микрофлюидной пластины, а также процедура получения и анализа изображений с интервальной съемкой. Целью данного эксперимента является наблюдение и анализ фенотипа персистенции при лечении антибиотиками на одноклеточном уровне. Данные, собранные в ходе этого эксперимента, могут быть использованы для получения широкого спектра результатов в зависимости от рассматриваемого вопроса и/или флуоресцентных репортеров, используемых во время эксперимента. В описанном здесь эксперименте был проведен количественный анализ длины клетки и флуоресценцииHU-mCherry 22, отражающий нуклеоидную организацию в персистентных и неперсистентных клетках. Культура бактериальных клеток для микрофлюидной покадровой микроскопииИнокулируйте 5 мл среды (глицерин MOPS 0,4%, при необходимости добавляя селективный антибиотик) изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и поместите пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 ° C и 180 об/мин на ночь (от 15 до 19 часов). На следующий день измерьте OD 600 нм и разбавьте культуру в свежей среде с регулируемой температурой (37 °C, глицерин MOPS 0,4%) в стеклянной пробирке до конечного OD600 нм ~ 0,001. Дайте культуре вырасти в течение ночи (от 15 до 19 часов) в встряхивающем инкубаторе при 37 ° C и 180 об/мин, чтобы получить раннюю экспоненциальную фазу культуры на следующий день. Подготовка микрофлюидной пластины и покадровая микроскопияПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидные эксперименты могут быть выполнены в коммерчески доступных микрофлюидных устройствах (как описано здесь) или в микрофлюидных системах собственного производства.Удалите консервирующий раствор (если он присутствует) из каждого отверстия микрофлюидной пластины и замените его свежей питательной средой.ПРИМЕЧАНИЕ: Если микрофлюидная пластина содержит выпускной колодец для отходов, консервационный раствор выпускного отверстия должен быть удален, но не заменен средой. Запечатайте микрофлюидную пластину с помощью системы коллектора, нажав кнопку «Уплотнение» или с помощью микрофлюидного программного обеспечения (сначала выберите «Инструмент», а затем «Уплотнительная пластина»).ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы герметизировать пластину, необходимо равномерно надавить на пластину и коллектор, вручную прижав пластину к коллектору. Если все выполнено правильно, на интерфейсе ONIX2 должна появиться пометка «запечатано». Важно не давить на предметное стекло, чтобы избежать потенциального риска поломки коллектора. После герметизации выполните первую последовательность заливки (нажмите « Запустить последовательность заливки жидкости » в интерфейсе микрофлюидного программного обеспечения).ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность прогонной заливки жидкости соответствует 5 минутам перфузии при давлении 6,9 кПа для скважин 1-5, затем 5 минутам перфузии при 6,9 кПа для скважины 8 и заключительному раунду перфузии для скважины 6 в течение 5 минут при 6,9 кПа. Последовательность жидкостного грунтования позволяет удалить консервационный раствор, который все еще может присутствовать в каналах, соединяющих различные скважины. Инкубируйте пластину в термостатическом шкафу микроскопа при желаемой температуре (в данном случае 37 °C) в течение как минимум 2 ч до начала микроскопии. Перед началом эксперимента запустите вторую последовательность жидкостной заливки . Запечатайте микрофлюидную пластину, нажав «Запечатать» в интерфейсе микрофлюидного программного обеспечения. Замените среду в лунке 1 и лунке 2 200 мкл свежей среды, в лунке 3 – 200 мкл свежей среды, содержащей антибиотик (в данном случае OFX при 5 мкг·мл-1), в лунке 4 и лунке 5 – 200 мкл свежей среды, в лунке 6 – 200 мкл свежей среды и в лунке 8 – 200 мкл образца культуры (из этапа 5.1.2), разбавленного до OD600 нм 0,01 в пресной среде. Запечатайте микрофлюидную пластину, как описано на шаге 5.2.2, и поместите пластину на объектив микроскопа внутри корпуса микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно нанесите каплю иммерсионного масла на объектив микроскопа перед установкой микрофлюидной пластины. В микрофлюидном программном обеспечении нажмите « Загрузка ячейки », чтобы разрешить загрузку ячейки в микрофлюидную пластину.ПРИМЕЧАНИЕ: Этап загрузки ячейки включает 15 с перфузии при 13,8 кПа для скважины 8, затем 15 с перфузии при 27,6 кПа для скважин 6 и 8 и заключительный перфузионный раунд для скважины 6 в течение 30 с при 6,9 кПа. Плотность клеток в микрофлюидной пластине имеет решающее значение для эксперимента. Первая часть этого микрофлюидного протокола состоит из выращивания бактерий в течение 6 часов в свежей среде перед лечением антибиотиками. Через 6 ч после роста плотность клеток должна быть достаточной для обнаружения редких персистентных клеток (в условиях, используемых в этом исследовании, персистентные клетки генерируются с частотой 10−4). Если плотность клеток слишком высока, трудно различить отдельные клетки, что препятствует точному анализу отдельных клеток. Поскольку скорость роста напрямую зависит от среды, перед началом эксперимента следует оценить плотность клеток в полях микроскопии. Установите оптимальный фокус с помощью режима проходящего света и выберите несколько областей интереса (ROI), где наблюдается соответствующее количество ячеек (до 300 ячеек на поле).ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите не менее 40 ROI, чтобы убедиться, что редкие персистентные клетки изображены. В микрофлюидном программном обеспечении нажмите « Создать протокол». Запрограммируйте инъекцию свежей среды при 6,9 кПа в течение 6 ч (лунка 1-2), затем инъекцию среды, содержащей антибиотик, при 6,9 кПа в течение 6 ч (лунка 3), и, наконец, инъекцию свежей среды при 6,9 кПа в течение 20 ч (лунки 4-5).ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальная культура, разбавленная до OD600 нм 0,01, позволяет бактериям расти в микрофлюидной камере в течение 6 часов, гарантируя, что клетки находятся в экспоненциальной фазе роста. В зависимости от количества клеток, введенных в микрофлюидное устройство на этапе загрузки (см. этап 5.2.8), продолжительность фазы роста может быть адаптирована для получения до 300 клеток на ROI. Поскольку персистенция является редким явлением, увеличение количества клеток на ROI улучшает возможность наблюдения персистентных клеток. Однако количество ячеек не должно превышать 300 ячеек на ROI, так как это делает анализ одной ячейки утомительным. Выполняйте микроскопическую визуализацию в режиме покадровой съемки с одним кадром каждые 15 минут, используя проходящий свет и источник возбуждающего света для флуоресцентного репортера. Здесь использовался источник возбуждающего света с длиной волны 560 нм для сигнала mCherry (светодиод 580 нм при мощности 10% с фильтром 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] и экспозиция 100 мс для mCherry). Для визуализации клеток использовалось программное обеспечение Zeiss-совместимое программное обеспечение Zen3.2. Анализ изображенийПРИМЕЧАНИЕ: Открытие и визуализация микроскопических изображений выполняются с помощью программного обеспечения ImageJ/Fiji с открытым исходным кодом (https://fiji.sc/)26. Количественный анализ изображений выполняется с использованием программного обеспечения ImageJ/Fiji с открытым исходным кодом и бесплатного плагина MicrobeJ (https://microbej.com)27. В этом протоколе использовалась версия MicrobeJ 5.13I(14).Откройте программное обеспечение ImageJ/Fiji на компьютере и перетащите изображения покадровой микроскопии Hyperstack на панель загрузки Fiji. Используйте Image > Color > Make Composite для слияния различных каналов гиперстека. Если каналы покадрового эксперимента не соответствуют желаемому цвету (например, фазовый контраст показан красным, а не серым), используйте «Изображение > цвет » > «Упорядочить каналы », чтобы применить соответствующий цвет к каналам. Откройте плагин MicrobeJ и обнаружите бактериальные клетки с помощью интерфейса ручного редактирования. Удалите автоматически обнаруженные ячейки и вручную обведите интересующие ячейки-сохранятели кадр за кадром.ПРИМЕЧАНИЕ: Для автоматического обнаружения отдельных ячеек можно использовать различные настройки. Здесь использовалось ручное обнаружение, поскольку анализируемые персистентные клетки образуют длинные филаменты, которые редко обнаруживаются правильно с помощью автоматического обнаружения. После обнаружения используйте значок «Результат » в интерфейсе ручного редактирования MicrobeJ, чтобы создать таблицу ResultJ. Сохраните файл ResultJ и используйте таблицу ResultJ, чтобы получить представление о различных параметрах, представляющих интерес для анализа одной ячейки. В случае этого протокола экспортировались средняя флуоресценция интенсивности HU-mCherry, длина клетки и площадь клеток отдельных клеток.