Analyse de population et de cellules uniques de la persistance des antibiotiques chez Escherichia coli

REMARQUE : Utilisez de la verrerie de culture stérile, des pointes de pipette et un milieu de croissance. Ici, les cellules d’E. coli ont été cultivées dans un milieu chimiquement défini à faible autofluorescence (voir le tableau des matériaux). Les inoculations ont été effectuées en présence d’un brûleur Bunsen afin de minimiser le risque de contamination. 1. Culture cellulaire et courbe de croissance Étaler la souche d’intérêt d’un stock de glycérol congelé sur une plaque de gélose Luria-Bertaini (LB) (complétée par un antibiotique sélectif, si nécessaire) et incuber à 37 °C pendant une nuit (entre 15 h et 19 h) pour obtenir des colonies uniques.NOTE: L’expérience présentée ici utilise deux souches, E. coli K-12 MG1655 correspondant à la souche poids et la souche isogénique MG1655 hupA-mCherry 22. Cette dernière souche exprime la α-sous-unité marquée par fluorescence de la protéine associée aux nucléoïdes HU. Le rapporteur hupA-mCherry est intégré au lieu natif de hupA. HU-mCherry sert de proxy pour suivre la dynamique nucléoïde dans les cellules vivantes lorsqu’il se lie à l’ADN d’une manière non spécifique. Inoculer 5 mL de milieu (ici, milieu à base d’acide 3-[N-morpholino]propanesulfonique [MOPS]; Tableau 1, Tableau 2 et Tableau 3) complété par du glucose à 0,4 % et un antibiotique sélectif (si nécessaire) avec une colonie isolée dans un tube de verre (≥25 mL), et placer le tube dans un incubateur à agitation réglé à 37 °C et 180 rotations par minute (tr/min) pendant la nuit (entre 15 h et 19 h). Alternativement, des tubes en plastique, en verre ou des flacons en plastique (≥ 25 mL) peuvent être utilisés à la place des tubes en verre.NOTE: Un milieu MOPS supplémenté en glycérol à une concentration finale de 0,4% a été utilisé tout au long des expériences décrites dans cet article, à l’exception des cultures de nuit qui ont été effectuées dans MOPS glucose 0,4%. Le temps de génération d’E. coli dans MOPS supplémenté en glucose est plus court que celui dans MOPS glycérol. L’utilisation de MOPS glucose 0,4% au lieu de MOPS glycérol 0,4% à cette étape garantit que les cellules atteignent la phase stationnaire dans les 19 heures. D’autres milieux de croissance, tels que M9 ou milieu riche défini (RDM) complété par des sources de carbone distinctes, peuvent également être utilisés. Il faut cependant noter que le taux de croissance et la fréquence de persistance sont différents selon le milieu et/ou le carbone utilisé23. Le lendemain matin, centrifuger 1 mL de culture à 2 300 x g pendant 3 min, jeter le surnageant et remettre délicatement la pastille en suspension dans le même volume de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mesurer la densité optique à 600 nm (DO 600 nm) et calculer le volume nécessaire pour une DOinitiale de 600 nm de 0,01 dans un volume final de 2 mL. Placer 2 mL de milieu de glycérol MOPS à 0,4 % dans un puits d’une plaque à fond clair de 24 puits et inoculer avec le volume de culture calculé pendant la nuit. Placer la plaque de 24 puits dans un lecteur de microplaques automatisé (voir le tableau des matériaux) pour surveiller la DO600 nm pendant 24 h. Réglez le lecteur de microplaques pour mesurer la DO600 nm toutes les 15 minutes à une température de 37 °C et avec une rotation orbitale élevée (140 tr/min).NOTE: Si la souche utilisée dans l’expérience code un rapporteur fluorescent, assurez-vous que son taux de croissance est comparable à celui du poids pour éviter tout artefact dans les expériences ultérieures, car le taux de croissance affecte la fréquence de persistance des antibiotiques23. En raison des limites de détection à très faibles densités cellulaires et des effets potentiels spécifiques à la souche sur la relation OD600 nm/unités formant colonies (UFC), il est recommandé d’évaluer la cinétique de croissance en surveillant la UFC-mL-1 lorsque l’on travaille avec des souches non caractérisées. 2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice des antibiotiques NOTE: La concentration minimale inhibitrice (CMI) est définie comme la dose la plus faible d’antibiotique à laquelle aucune croissance bactérienne n’est observée. La détermination de la CMI doit être effectuée pour chaque antibiotique et souche. Dans les expériences décrites ici, l’antibiotique fluoroquinolone ofloxacine (OFX) a été utilisé. La détermination de la CMI permet de confirmer que la solution antibiotique a été correctement préparée, que l’antibiotique est actif et que les souches sont également sensibles à l’antibiotique. Ici, la méthode de dilution de gélose publiée a été réalisée pour déterminer la CMI à OFX des différentes souches utilisées24. La CMI d’un antibiotique donné pour une souche bactérienne donnée peut également être déterminée par la méthode de dilution du bouillon24. Préparation des tôles pour la détermination de la CMIPréparer une solution mère pour l’antibiotique utilisé dans les expériences en dissolvant 5 mg d’OFX dans 1 mL d’eau ultrapure. Ajouter 20 μL de HCl à 37% pour augmenter la solubilité de l’OFX. Faire fondre 100 mL de gélose LB stérile et la conserver à 55 °C pour éviter la solidification. Préparer six petites fioles en verre (25 mL) et pipeter 5 mL de gélose LB liquide dans chaque fiole à l’aide d’une pipette stérile. Diluer 10 μL de la solution mère OFX à 5 mg·mL-1 dans 90 μL d’eau ultrapure (dilution 1:10 du stock principal). Ajouter 0 μL, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL ou 10 μL de la solution OFX de 500 μg·mL-1 à chacun des six flacons en verre contenant 5 mL de milieu gélosé LB pour générer un milieu gélosé LB avec des concentrations finales de 0 μg·mL−1, 0,02 μg·mL−1, 0,04 μg·mL−1, 0,06 μg·mL−1, 0,08 μg·mL−1 et 0,1 μg·mL-1 OFX, respectivement. Mélangez la solution en tournant les flacons plusieurs fois.REMARQUE : Si la CMI de l’antibiotique d’intérêt est connue, la plage de concentrations devrait aller de bas en bas à au-dessus de la CMI réelle. Si la CMI est inconnue, une large gamme de concentrations avec une série de dilutions logarithmique2 est recommandée. Assurez-vous que le milieu gélosé LB a refroidi avant d’ajouter l’antibiotique, car des températures élevées peuvent l’inactiver. Néanmoins, il est important de ne pas laisser le milieu gélosé LB se solidifier avant d’ajouter l’antibiotique, car cela pourrait conduire à une distribution non homogène de l’antibiotique dans le milieu gélosé LB. Verser 5 mL de chacun des six milieux gélose LB préparés à l’étape 2.1.3 de manière croissante dans une plaque de culture à 6 puits à l’aide d’une pipette stérile. Laisser la gélose refroidir jusqu’à solidification et sécher la plaque avant utilisation.NOTE: Préparez la solution antibiotique et la plaque de culture le jour où le test est effectué. Dosage de détermination de la CMIInoculer 5 mL de milieu LB avec une colonie isolée dans un tube de verre (≥25 mL) et placer le tube de verre dans un incubateur à agitation réglé à 37 °C et 180 tr/min pendant la nuit (entre 15 h et 19 h). Le lendemain matin, mesurer la DO600 nm et diluer la culture dans un tube à essai jusqu’à obtenir une densité cellulaire finale de 1 x 107 UFC·mL-1 dans du PBS. Pour les souches testées ici, 1 x 107 UFC·mL−1 correspond à une DO600 nm de 0,0125.NOTE: Si la corrélation entre l’UFC·mL-1 et la DO 600 nm nm n’est pas connue, la courbe de croissance déterminée par les mesures UFC et OD 600 nm doit être établie pour calculer le facteur de corrélation entre l’UFC·mL-1 et DO600 nm. Repérez 2 μL de la culture préalablement diluée sur chaque puits de la plaque séchée à 6 puits. Laisser sécher les taches avant de placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit (entre 15 h et 19 h). Le lendemain, comptez les colonies formées dans chaque puits. La CMI correspond au puits avec la concentration minimale d’antibiotique où aucune croissance bactérienne n’est détectée. 3. Essai ponctuel NOTE: La méthode de dosage ponctuel est une approche qualitative qui permet d’estimer le nombre de cellules viables (cellules capables de générer des colonies après un stress antibiotique). Le test ponctuel est effectué avant le test time-kill afin de fournir des informations sur la viabilité de la souche utilisée dans les conditions testées et d’informer sur les dilutions nécessaires pendant l’essai time-kill (voir rubrique 4). Pour préparer les plaques de gélose LB pour les dosages localisés, verser 50 ml de gélose LB dans une boîte de Petri carrée (144 cm2). Préparez une boîte de Petri carrée par point temporel. Laissez la gélose LB se solidifier et séchez les plaques avant utilisation. Inoculer 5 mL de milieu (glucose MOPS 0,4 %) avec une colonie isolée dans un tube de verre (≥25 mL) et placer le tube dans un incubateur à agitation réglé à 37 °C et 180 tr/min pendant la nuit (entre 15 h et 19 h). Le lendemain, mesurer la DO600 nm et diluer la culture dans un milieu frais ajusté en température (37 °C, MOPS glycérol 0,4%) dans un tube de verre (≥25 mL) jusqu’à une DO finale de600 nm de ~0,001 . Laisser pousser la culture pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C à 180 rpm (entre 15 h et 19 h). Le lendemain, mesurer la DO 600 nm et incuber la culture à une DOfinale de 600 nm de 0,3. Pendant l’incubation, préparer des plaques de 96 puits en plaçant 90 μL de solution de MgSO4 0,01 M dans chaque puits, sauf les puits de la première rangée (rangée A). Les plaques à 96 puits seront utilisées pour une dilution en série 10 fois à l’étape 3.7.NOTE: Dans cette expérience, deux souches (wt et hupA-mCherry ) ont été testées en triple à sept moments différents. Comme une plaque comprend 12 colonnes, une plaque peut être utilisée pour deux points temporels et, par conséquent, un total de quatre plaques ont été préparées. À une DO de600 nm de 0,3, prélever 200 μL de chaque culture bactérienne. Ces échantillons correspondent au point de temps t0 (non traité) avant le traitement antibiotique et permettent de déterminer l’UFC·mL-1 avant le traitement antibiotique. Centrifuger les échantillons à 2 300 x g pendant 3 min. Pendant le temps de centrifugation, ajouter la concentration souhaitée d’OFX à la culture liquide et continuer à incuber à 37 °C en agitant.NOTE: Ici, OFX a été utilisé à une concentration de 5 μg·mL-1 (correspondant à la CMI multipliée par 83). Dans une étude antérieure, cette concentration a été utilisée pour caractériser le phénomène de persistance sous exposition à OFX25. La concentration d’antibiotiques utilisée pour les tests de temps/destruction peut varier en fonction de l’antibiotique, du milieu de culture et de l’état de croissance bactérienne. Après centrifugation, remettre en suspension la pastille de la cellule dans 200 μL de solution 0,01 M deMgSO4 . Placer 100 μL dans le puits vide de la plaque de 96 puits préparée à l’étape 3.5. Effectuer une dilution en transférant 10 μL du puits de la rangée A dans le puits de la rangée B contenant 90 μL de 0,01 M deMgSO4. Poursuivre les dilutions en série en transférant 10 μL du puits de la rangée B dans le puits de la rangée C. Répéter jusqu’à obtention d’une dilution de 10−7 (chaque transfert étant une dilution de 10 fois).NOTE: Dans cette expérience, six cultures (trois pour la souche wt et trois pour la souche hupA-mCherry ) ont été testées pour chaque point temporel. Selon le protocole, une pipette à canal multiple est utilisée pour effectuer les dilutions en série pour les six souches en même temps. Pour minimiser l’erreur technique, les pointes des pipettes sont changées entre chaque transfert. Placer 10 μL de chaque dilution sur les plaques de gélose LB préparées à l’étape 3.1.NOTA: Une pipette multicanal est utilisée pour repérer simultanément la même dilution (par exemple, une dilution 10−4 ) pour les six cultures. Pendant le repérage, la première butée de la pipette multicanal doit être utilisée sans appuyer sur la deuxième butée, car cela peut entraîner la distribution de microgouttelettes sur la plaque. Aux moments pertinents après l’ajout d’antibiotiques, prélever 200 μL de la culture et effectuer des dilutions en série comme décrit à l’étape 3.8. Repérer 10 μL de chaque dilution comme décrit à l’étape 3.9.NOTE: Pour l’expérience décrite ici, sept points temporels ont été collectés (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Pour les souches présentant une sensibilité accrue aux antibiotiques par rapport au poids, plusieurs lavages dans MgSO4 0,01 M peuvent être effectués pour éliminer les antibiotiques résiduels. Incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit (entre 15 h et 19 h). Le lendemain, compter le nombre de colonies aux deux dilutions les plus élevées pour lesquelles des colonies peuvent être détectées. Idéalement, les taches sur les plaques de gélose pour ces dilutions contiennent entre 3 et 30 colonies permettant la détermination précise de l’UFC·mL-1 pour chaque échantillon. Calculer le rapport de survie en divisant l’UFC·mL-1 calculée de chaque point temporel par l’UFC·mL-1 de la population initiale à t0. 4. Tests time-kill REMARQUE: Alors que les tests ponctuels sont une méthode facile à utiliser pour estimer le taux de survie d’une souche donnée pour un antibiotique donné, les tests time-kill donnent un taux de survie à plus haute résolution et sont effectués pour quantifier avec précision la viabilité bactérienne. Le profil de la courbe de destruction peut être utilisé pour déterminer si une souche bactérienne donnée est sensible, tolérante ou résistante à l’antibiotique dans une condition donnée. De plus, les tests time-kill permettent de déterminer le temps d’exposition aux antibiotiques nécessaire pour détecter le phénomène de persistance (début de la deuxième pente de la courbe de destruction biphasique) ainsi que la fréquence de persistance. Préparer les plaques de gélose LB pour le test de placage time-killing. Verser 25 ml de gélose LB dans une boîte de Petri (±57 cm2). Préparer au moins deux boîtes de Petri par point de temps (deux dilutions par point de temps et par souche sont plaquées). Laissez la gélose LB se solidifier et séchez les assiettes avant d’ajouter cinq à huit billes de verre stériles à chaque plaque. Retourner et étiqueter les plaques en fonction de la déformation/condition/point temporel.NOTE: Les billes de verre permettent la propagation des bactéries sur les plaques de gélose au cours des étapes 4.7 et 4.9. Alternativement, les cellules peuvent être dispersées sur la plaque de gélose à l’aide d’un épandeur. Pour chaque échantillon, préparer 10 tubes en verre de dilution en série contenant 900 μL de solution 0,01 M deMgSO4 . Le nombre de tubes de verre de dilution par échantillon à préparer correspond aux dilutions nécessaires pour détecter les colonies dans le test localisé. Inoculer 5 mL de milieu (glucose MOPS 0,4 %) avec une colonie isolée dans un tube de verre (≥25 mL) et placer le tube dans un incubateur à agitation réglé à 37 °C et 180 tr/min pendant la nuit (entre 15 h et 19 h). Après 16 h de croissance, mesurer la DO 600 nm et diluer la culture dans un milieu frais ajusté en température (37 °C, MOPS glycérol 0,4 %) dans un tube de verre jusqu’à obtenir une DO finale de600 nm de ~0,001. Laisser pousser la culture pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C à 180 rpm (entre 15 h et 19 h). Le lendemain, mesurer la DO 600 nm et incuber la culture à une DOfinale de 600 nm de 0,3. A une DO 600 nm de 0,3, prélever 100 μL de la culture, diluer selon les données obtenues dans le spot (à une DO600 nm de 0,3 et sans antibiotique, une dilution 10−5 donne généralement 200-300 colonies), et plaquer100 μL sur les plaques de gélose LB préparées aux étapes 4.1-4.2. Secouez doucement les assiettes pour éviter que les billes ne touchent les bords de la boîte, car cela peut entraîner une propagation non homogène des cellules bactériennes sur le milieu gélosé LB. Ce premier échantillon avant le traitement antibiotique correspond au point de temps t0 (UFC·mL-1 avant traitement antibiotique). Ajouter la concentration désirée d’OFX et continuer à incuber à 37 °C en agitant.NOTE: Ici, OFX a été utilisé à une concentration de 5 μg·mL-1 (correspondant à la CMI multipliée par 83). Aux moments pertinents après l’ajout d’antibiotiques, prélever 100 μL de la culture, diluer selon les données obtenues dans le dosage local, et plaquer 100 μL sur les plaques de gélose LB préparées aux étapes 4.1-4.2. Plaquez les cellules comme décrit à l’étape 4.7.NOTE: Pour l’expérience décrite ici, sept points temporels ont été collectés (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Pour les souches présentant une sensibilité accrue aux antibiotiques par rapport au poids, plusieurs lavages dans MgSO4 0,01 M peuvent être effectués pour éliminer les antibiotiques résiduels. Incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit (entre 15 h et 19 h). Le lendemain, compter le nombre de colonies aux deux dilutions les plus élevées pour lesquelles des colonies peuvent être détectées. Idéalement, les plaques devraient contenir 30 à 300 colonies pour permettre une détermination précise de l’UFC·mL-1 dans chaque échantillon. Calculer le rapport de survie en normalisant l’UFC·mL-1 à chaque point temporel par l’UFC·mL-1 à t0. Tracer le logarithme10 UFC·mL-1 normalisé en fonction du temps. 5. Imagerie microfluidique en microscopie accélérée REMARQUE: La section suivante décrit la préparation de la plaque microfluidique ainsi que la procédure d’acquisition d’images et d’analyse d’images en accéléré. Le but de cette expérience est d’observer et d’analyser le phénotype de persistance lors d’un traitement antibiotique au niveau unicellulaire. Les données recueillies au cours de cette expérience peuvent être utilisées pour générer un large éventail de résultats en fonction de la question abordée et/ou des rapporteurs fluorescents utilisés pendant l’expérience. Dans l’expérience décrite ici, une analyse quantitative de la longueur de la cellule et de la fluorescence HU-mCherry22, reflétant l’organisation nucléoïde dans les cellules persistantes et non persistantes, a été réalisée. Culture cellulaire bactérienne pour microscopie accélérée microfluidiqueInoculer 5 mL de milieu (MOPS glycérol 0,4 %, complété par un antibiotique sélectif si nécessaire) avec une colonie isolée dans un tube de verre (≥25 mL), et placer le tube dans un incubateur à agitation réglé à 37 °C et 180 tr/min pendant la nuit (entre 15 h et 19 h). Le lendemain, mesurer la DO 600 nm et diluer la culture dans un milieu frais ajusté en température (37 °C, MOPS glycérol 0,4%) dans un tube en verre jusqu’à obtenir une DO finale de600 nm de ~0,001. Laisser pousser la culture pendant la nuit (entre 15 h et 19 h) dans un incubateur à agitation à 37 °C et 180 rpm pour obtenir une culture précoce en phase exponentielle le lendemain. Préparation de la plaque microfluidique et imagerie microscopique time-lapseREMARQUE: Les expériences microfluidiques peuvent être effectuées dans des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce (comme décrit ici) ou dans des systèmes microfluidiques produits en interne.Retirer la solution de conservation (si présente) de chaque puits de la plaque microfluidique et la remplacer par un milieu de culture frais.NOTA : Si la plaque microfluidique contient un puits de sortie d’eaux usées, la solution de conservation du puits de sortie doit être retirée mais non remplacée par le milieu. Scellez la plaque microfluidique avec le système collecteur en cliquant sur le bouton Seal ou via le logiciel microfluidique (sélectionnez d’abord Outil, puis Plaque d’étanchéité).REMARQUE: Pour sceller la plaque, une pression uniforme doit être appliquée à la plaque et au collecteur en pressant manuellement la plaque contre le collecteur. Si cela est effectué correctement, la note « scellé » devrait apparaître sur l’interface ONIX2. Il est important de ne pas appliquer de pression sur la lame de verre pour éviter tout risque potentiel de rupture du collecteur. Une fois scellé, effectuez une première séquence d’amorçage (cliquez sur Run Liquid Priming Sequence sur l’interface du logiciel microfluidique).REMARQUE : La séquence d’amorçage liquide d’exécution correspond à 5 min de perfusion à 6,9 kPa pour les puits 1 à 5, suivies de 5 min de perfusion à 6,9 kPa pour le puits 8 et d’une dernière ronde de perfusion pour le puits 6 pendant 5 min à 6,9 kPa. La séquence d’amorçage du liquide Run permet d’éliminer la solution de conservation qui peut encore être présente dans les canaux reliant les différents puits. Incuber la plaque dans une armoire thermostatique du microscope à la température souhaitée (ici, 37 °C) pendant au moins 2 h avant le début de l’imagerie microscopique. Commencez une deuxième séquence d’amorçage liquide avant de commencer l’expérience . Scellez la plaque microfluidique en cliquant sur Seal off sur l’interface du logiciel microfluidique. Remplacer le milieu dans le puits 1 et le puits 2 par 200 μL de milieu frais, dans le puits 3 par 200 μL de milieu frais contenant l’antibiotique (ici, OFX à 5 μg·mL−1), dans le puits 4 et le puits 5 avec 200 μL de milieu frais, dans le puits 6 avec 200 μL de milieu frais, et dans le puits 8 avec 200 μL de l’échantillon de culture (à partir de l’étape 5.1.2) dilué à une DO600 nm de 0,01 dans le milieu frais. Scellez la plaque microfluidique comme décrit à l’étape 5.2.2 et placez la plaque sur l’objectif du microscope à l’intérieur de l’armoire de microscope.REMARQUE: Assurez-vous de placer une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope avant de placer la plaque microfluidique. Dans le logiciel microfluidique, cliquez sur Chargement de cellule pour permettre le chargement de la cellule dans la plaque microfluidique.NOTA : L’étape de chargement des cellules comprend 15 s de perfusion à 13,8 kPa pour le puits 8, suivies de 15 s de perfusion à 27,6 kPa pour le puits 6 et le puits 8, et d’une dernière ronde de perfusion pour le puits 6 pendant 30 s à 6,9 kPa. La densité des cellules dans la plaque microfluidique est critique pour l’expérience. La première partie de ce protocole microfluidique consiste à cultiver des bactéries pendant 6 h dans un milieu frais avant le traitement antibiotique. Après 6 h de croissance, la densité cellulaire doit être suffisante pour détecter les cellules persistantes rares (dans les conditions utilisées dans cette étude, les cellules persistantes génèrent à une fréquence de 10−4). Si la densité cellulaire est trop élevée, il est difficile de distinguer les cellules individuelles, ce qui empêche une analyse précise d’une seule cellule. Comme le taux de croissance dépend directement du milieu, la densité des cellules dans les champs de microscopie doit être évaluée avant de lancer l’expérience. Réglez une mise au point optimale à l’aide du mode de lumière transmise et sélectionnez plusieurs régions d’intérêt (ROI) où un nombre de cellules approprié est observé (jusqu’à 300 cellules par champ).REMARQUE: Sélectionnez au moins 40 ROI pour vous assurer que les cellules persistantes rares sont imagées. Sur le logiciel microfluidique, cliquez sur Créer un protocole. Programmer l’injection de milieu frais à 6,9 kPa pendant 6 h (puits 1-2), suivie de l’injection du milieu contenant l’antibiotique à 6,9 kPa pendant 6 h (puits 3), et, enfin, l’injection du milieu frais à 6,9 kPa pendant 20 h (puits 4-5).NOTE: Une culture bactérienne diluée à une OD600 nm de 0,01 permet aux bactéries de se développer dans la chambre microfluidique pendant 6 h, assurant que les cellules sont dans la phase de croissance exponentielle. En fonction du nombre de cellules introduites dans le dispositif microfluidique lors de l’étape de chargement (voir étape 5.2.8), la durée de la phase de croissance peut être adaptée pour obtenir jusqu’à 300 cellules par ROI. La persistance étant un phénomène rare, l’augmentation du nombre de cellules par ROI améliore la possibilité d’observer les cellules persistantes. Le nombre de cellules ne doit cependant pas dépasser 300 cellules par retour sur investissement, car cela rend l’analyse unicellulaire fastidieuse. Effectuez l’imagerie microscopique en mode time-lapse avec une image toutes les 15 minutes en utilisant la lumière transmise et la source lumineuse d’excitation pour le rapporteur fluorescent. Ici, une source lumineuse d’excitation de 560 nm pour le signal mCherry a été utilisée (LED 580 nm à 10% de puissance avec filtre 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] et exposition de 100 ms pour mCherry). Le logiciel Zen3.2 compatible Zeiss a été utilisé pour l’imagerie cellulaire. Analyse d’imagesNOTE: L’ouverture et la visualisation des images de microscopie sont effectuées avec le logiciel open source ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)26. L’analyse quantitative des images est effectuée à l’aide du logiciel open source ImageJ/Fiji et du plugin gratuit MicrobeJ (https://microbej.com)27. Dans ce protocole, la version MicrobeJ 5.13I(14) a été utilisée.Ouvrez le logiciel ImageJ/Fiji sur l’ordinateur et faites glisser les images de microscopie time-lapse hyperstack dans la barre de chargement Fiji. Utilisez Image > Color > Make Composite pour fusionner les différents canaux de l’hyperpile. Si les couches de l’expérience accélérée ne correspondent pas à la couleur souhaitée (par exemple, le contraste de phase est affiché en rouge au lieu de gris), utilisez Image > Couleur > Organiser les couches pour appliquer la couleur appropriée aux couches. Ouvrez le plugin MicrobeJ et détectez les cellules bactériennes à l’aide de l’interface d’édition manuelle. Supprimez les cellules détectées automatiquement et délimitez manuellement les cellules persistantes d’intérêt image par image.REMARQUE: Différents paramètres peuvent être utilisés pour détecter automatiquement des cellules individuelles. La détection manuelle a été utilisée ici car les cellules persistantes analysées forment de longs filaments, qui sont rarement détectés correctement à l’aide de la détection automatique. Après la détection, utilisez l’icône Résultat dans l’interface d’édition manuelle MicrobeJ pour générer une table ResultJ. Enregistrez le fichier ResultJ et utilisez la table ResultJ pour obtenir des informations sur les différents paramètres d’intérêt de l’analyse unicellulaire. Dans le cas de ce protocole, la fluorescence moyenne de l’intensité HU-mCherry, la longueur de la cellule et la surface cellulaire des cellules individuelles ont été exportées.