フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

T細胞受容体(TCR)誘導性カルシウム流入は、T細胞活性化の有用な尺度であり、T細胞の集団がTCRシグナル伝達経路¹の近位ステップで応答を障害しているかどうかを判断するために頻繁に使用されます。カルシウム流入の測定は、一般に、T細胞を1つまたは1対の蛍光カルシウム指示色素で予め標識し、次いでTCR架橋後にフローサイトメトリーを用いて蛍光シグナルをリアルタイムで調べることによって行われる^2,3,4。レシオメトリックカルシウム色素であるインド-1は、カルシウム結合に依存する2つの異なる波長でピーク発光するUVレーザーによって励起^され5、生リンパ球におけるカルシウム応答のフローサイトメトリー分析に一般的に使用される指標色素です。Indo-1の発光プロファイルは非常に広いため、Indo-1評価とバンドパスフローサイトメトリーによる複数の細胞表面マーカーの同時分析を組み合わせることは困難な場合があります。この制限により、カルシウム応答のフローサイトメトリー分析の利用は、T細胞の事前に精製された集団または限られた細胞表面分子のセットによって同定された集団に制限されます。

バンドパスフローサイトメトリーを使用して初代リンパ球の不均一な集団に対するカルシウム応答を測定することの限界に対処するために、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してIndo-1蛍光を測定するためのプロトコルが開発されました。この方法では、フルスペクトルフローサイトメトリーの柔軟性の高い機能を利用して、細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでIndo-1をマルチプレックス化することができます。従来のフローサイトメトリーよりもフルスペクトルフローサイトメトリーを使用する利点は、蛍光シグナルを高度に重なり合う色素から区別できるため、各サンプルで同時に評価できる表面マーカーの数が増えることです。従来のフローサイトメトリーはバンドパスフィルターを使用し、検出器システム⁶あたり1つの蛍光色素に制限されています。フルスペクトルフローサイトメトリーは、5レーザースペクトルフローサイトメトリーシステム上の64個の検出器を使用して、蛍光色素の全スペクトルにわたってシグナルを収集します^7,8。さらに、フルスペクトルフローサイトメトリーは、従来のフロー^{サイトメーター8}に存在する光電子増倍管検出器と比較して感度が向上したAPD(アバランシェフォトダイオード)検出器を利用します。したがって、このアプローチは、カルシウム色素標識の前に特定のT細胞集団を単離する必要がないため、末梢血単核細胞やマウス二次リンパ器官細胞懸濁液などの不均一な細胞集団に最適です。代わりに、データ収集後の細胞表面マーカー発現プロファイルとフローサイトメトリーゲーティングを使用して、関心のある各集団におけるカルシウム応答を評価できます。このレポートで示されているように、Indo-1は8つの蛍光色素結合抗体と容易に組み合わせることができ、合計10のユニークなスペクトルシグネチャが得られます。さらに、この方法は、先天的に異なるマウス系統の細胞の混合物に容易に適用することができ、遺伝子標的マウス株からのものと比較して、野生型T細胞におけるカルシウム応答の同時解析を可能にする。