Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

L’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T (TCR) est une mesure utile de l’activation des lymphocytes T et est fréquemment utilisé pour déterminer si une population de lymphocytes T a des réponses altérées dans les étapes proximales de la voie de signalisation TCR¹. Les mesures de l’afflux de calcium sont généralement effectuées en pré-marquant les lymphocytes T avec un ou une paire de colorants indicateurs de calcium fluorescents, puis en examinant les signaux fluorescents en utilisant la cytométrie de flux en temps réel après réticulation ^{TCR 2,3,4}. Indo-1, un colorant calcique proportionnel, est excité par le laser UV avec des émissions de pointe à deux longueurs d’onde différentes en fonction de la liaison au calcium⁵, et est un colorant indicateur couramment utilisé pour l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques dans les lymphocytes vivants. Comme le profil d’émission d’Indo-1 est assez large, il peut être difficile de combiner l’évaluation de l’Indo-1 avec l’analyse simultanée de plusieurs marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux passe-bande. Cette limitation limite l’utilisation de l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques aux populations pré-purifiées de lymphocytes T ou aux populations identifiées par un ensemble limité de molécules de surface cellulaire.

Pour remédier aux limites de la mesure des réponses calciques sur des populations hétérogènes de lymphocytes primaires à l’aide de la cytométrie en flux passe-bande, un protocole a été développé pour mesurer la fluorescence Indo-1 à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet. Cette méthode permet de multiplexer Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire, en tirant parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet. L’avantage de l’utilisation de la cytométrie en flux à spectre complet par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle est sa capacité à distinguer les signaux fluorescents des colorants qui se chevauchent fortement, augmentant ainsi le nombre de marqueurs de surface qui peuvent être évalués simultanément dans chaque échantillon. La cytométrie de flux conventionnelle utilise des filtres passe-bande et est limitée à un fluorochrome par système de détection⁶. La cytométrie en flux à spectre complet recueille des signaux sur tout le spectre du fluorochrome à l’aide de 64 détecteurs sur un système de cytométrie spectrale en flux^à cinq lasers ^7,8. De plus, la cytométrie en flux à spectre complet tire parti des détecteurs APD (Avalanche Photo Diode) qui ont une sensibilité accrue par rapport aux détecteurs à tube photomultiplicateur présents sur les cytomètres en flux conventionnels⁸. Par conséquent, cette approche est idéale pour les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules mononucléées du sang périphérique ou les suspensions de cellules d’organes lymphoïdes secondaires murins, car elle élimine le besoin d’isoler des populations spécifiques de lymphocytes T avant le marquage du colorant calcique. Au lieu de cela, les profils d’expression des marqueurs de surface cellulaire et la cytométrie en flux après la collecte de données peuvent être utilisés pour évaluer les réponses au calcium dans chaque population d’intérêt. Comme le montre ce rapport, Indo-1 peut facilement être combiné avec huit anticorps conjugués au fluorochrome, ce qui donne un total de 10 signatures spectrales uniques. En outre, cette méthode peut être facilement appliquée à des mélanges de cellules de lignées de souris congéniquement distinctes, permettant l’analyse simultanée des réponses calciques dans les cellules T de type sauvage par rapport à celles d’une lignée de souris ciblant un gène.