تحليل تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية في الخلايا التائية الأولية عن طريق قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف
Summary
يعد تدفق الكالسيوم ، وهو مقياس لإشارات الخلايا التائية ، طريقة فعالة لتحليل الاستجابات لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية. يستفيد هذا البروتوكول لتعدد إرسال Indo-1 مع لوحات من الأجسام المضادة الموجهة إلى جزيئات سطح الخلية من القدرات المرنة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل.
Abstract
يعد تدفق الكالسيوم استجابة لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية مقياسا شائعا لإشارات الخلايا التائية. تم تطوير العديد من أصباغ مؤشر الكالسيوم لتقييم إشارات الكالسيوم عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. تم تصميم هذا البروتوكول لقياس استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. يتم تمييز الخلايا الطحالية الكلية بصبغة مؤشر الكالسيوم النسبي Indo-1 ، جنبا إلى جنب مع لوحة من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم لجزيئات سطح الخلية. توفر الاستفادة من قدرات قياس التدفق الخلوي كامل الطيف منصة لاستخدام مجموعة واسعة من بقع سطح الخلية بالاشتراك مع Indo-1. ثم يتم تحليل الخلايا في الوقت الفعلي عند 37 درجة مئوية قبل وبعد إضافة جسم مضاد ل CD3 لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية. بعد فك خلط الإشارات الطيفية ، يتم حساب نسبة Indo-1 المرتبط بالكالسيوم إلى Indo-1 الخالي من الكالسيوم ويمكن تصوره بمرور الوقت لكل مجموعة مسورة من الخلايا الطحالية. يمكن أن تسمح هذه التقنية بالتحليل المتزامن لاستجابات الكالسيوم في مجموعات خلايا متعددة.
Introduction
يعد تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR) مقياسا مفيدا لتنشيط الخلايا التائية وكثيرا ما يستخدم لتحديد ما إذا كانت مجموعة الخلايا التائية قد ضعفت الاستجابات في الخطوات القريبة من مسار إشارات TCR1. يتم إجراء قياسات تدفق الكالسيوم بشكل عام عن طريق وضع العلامات المسبقة على الخلايا التائية بواحد أو زوج من أصباغ مؤشر الكالسيوم الفلورية ، ثم فحص إشارات الفلورسنت باستخدام قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي بعد ربط TCRالمتقاطع 2،3،4. يتم إثارة Indo-1 ، صبغة الكالسيوم المترية النسبة ، بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية مع انبعاثات الذروة عند طولين موجيين مختلفين يعتمدان على ارتباط الكالسيوم5 ، وهو صبغة مؤشر شائعة الاستخدام لتحليل قياس التدفق الخلوي لاستجابات الكالسيوم في الخلايا الليمفاوية الحية. نظرا لأن ملف تعريف انبعاث Indo-1 واسع جدا ، فقد يكون من الصعب الجمع بين تقييم Indo-1 والتحليل المتزامن لعلامات سطح الخلية المتعددة عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. يقيد هذا القيد استخدام تحليل التدفق الخلوي لاستجابات الكالسيوم لمجموعات الخلايا التائية المنقاة مسبقا أو المجموعات التي تحددها مجموعة محدودة من جزيئات سطح الخلية.
لمعالجة قيود قياس استجابات الكالسيوم على المجموعات غير المتجانسة من الخلايا الليمفاوية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي بتمرير النطاق ، تم تطوير بروتوكول لقياس مضان Indo-1 باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. تسمح هذه الطريقة بتعدد إرسال Indo-1 بألواح من الأجسام المضادة الموجهة إلى جزيئات سطح الخلية ، مع الاستفادة من القدرات المرنة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. تتمثل ميزة استخدام قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف على قياس التدفق الخلوي التقليدي في قدرته على تمييز إشارات الفلورسنت عن الأصباغ شديدة التداخل ، وبالتالي زيادة عدد العلامات السطحية التي يمكن تقييمها في وقت واحد في كل عينة. يستخدم قياس التدفق الخلوي التقليدي مرشحات تمرير النطاق ويقتصر على فلوروكروم واحد لكل نظام كاشف6. يجمع قياس التدفق الخلوي كامل الطيف الإشارات عبر الطيف الكامل للفلوروكروم باستخدام 64 كاشفا على نظام قياس التدفق الخلوي بخمسة ليزر 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، يستفيد قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل من كاشفات APD (Avalanche Photo Diode) التي زادت من الحساسية بالنسبة لكاشفات أنبوب المضاعف الضوئي الموجودة في مقاييس التدفق الخلويالتقليدية 8. وبالتالي ، فإن هذا النهج مثالي لمجموعات الخلايا غير المتجانسة ، مثل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية أو معلقات خلايا الأعضاء اللمفاوية الثانوية للفئران ، لأنه يلغي الحاجة إلى عزل مجموعات معينة من الخلايا التائية قبل وضع علامات صبغة الكالسيوم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ملفات تعريف تعبير علامات سطح الخلية وبوابات قياس التدفق الخلوي بعد جمع البيانات لتقييم استجابات الكالسيوم في كل مجموعة من السكان موضع الاهتمام. كما هو موضح في هذا التقرير ، يمكن بسهولة دمج Indo-1 مع ثمانية أجسام مضادة مقترنة بالفلوروكروم ، مما ينتج عنه ما مجموعه 10 توقيعات طيفية فريدة. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على مخاليط الخلايا من خطوط الفئران المتميزة وراثيا ، مما يسمح بالتحليل المتزامن لاستجابات الكالسيوم في الخلايا التائية من النوع البري مقارنة بتلك الموجودة في خط الفئران المستهدف بالجينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول مقايسة محسنة مصممة لقياس استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية المحملة بصبغة مؤشر Indo-1 المعايرة باستخدام قياس التدفق الخلويلتدفق الطيف الكامل 7,8. تتمثل ميزة إجراء فحوصات تدفق الكالسيوم باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01AI132419 ، CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource ، RRID: SCR_021321 ، شكرا جزيلا لزملائنا في Cytek على المناقشات المستمرة للتحليل الخلوي الطيفي الكامل على برنامج Aurora و SpectroFlo. تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.
Materials
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022)
- SpctroFlo Software. Cytek Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022)
- FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022)
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
