Imagem de células vivas de globos ex vivo intactos usando um novo suporte impresso em 3D

Córnea
A córnea é uma estrutura clara e avascular que cobre a superfície anterior do olho que refrata a luz para permitir a visão e protege o interior do olho de danos. Como a córnea é exposta ao meio ambiente, é suscetível a danos causados por causas mecânicas (arranhões) e por infecções. Uma lesão na córnea em um paciente saudável normalmente cura dentro de 1-3 dias. No entanto, em pacientes com condições subjacentes, incluindo deficiência de células-tronco límbicas e diabetes tipo II, o processo de cicatrização de feridas na córnea pode ser bastante prolongado¹. Como a córnea é altamente inervada, essas úlceras corneanas não cicatrizantes e erosões recorrentes da córnea são muito dolorosas e diminuem muito a qualidade de vida dos pacientes que as vivenciam¹.

Sinalização celular
Quando uma córnea saudável é lesada, os eventos de sinalização de cálcio nas células adjacentes à ferida precedem e provocam a migração celular para o leito da ferida, onde fecham a lesão sem o risco de cicatrizes ^2,3. Esses eventos de sinalização têm sido bem caracterizados em modelos de cultura de células epiteliais corneanas utilizando imagens de células vivas². Experimentos preliminares demonstram significativamente mais sinalização de cálcio após lesão em células não diabéticas em comparação com células diabéticas. No entanto, a caracterização dos eventos de sinalização celular em globos ex vivo tem se mostrado um desafio técnico.

Imagem de células vivas
Estudos anteriores registraram com sucesso eventos de sinalização de cálcio a partir de modelos de cultura celular in vitro de cicatrização de feridas corneanas ^4,5,6. O desenvolvimento de uma metodologia para produzir imagens de alta qualidade desses eventos de sinalização em tecido ex vivo é de grande interesse, pois permitiria o estudo desses eventos em um sistema mais complexo e realista. Abordagens anteriores envolveram dissecção da córnea seguida de imobilização em gel PEG induzido por UV ^7,8,9. A imobilização é um passo essencial, mas desafiador, ao trabalhar com tecido vivo, pois deve permanecer viável e hidratado durante todo o curso do experimento. Além disso, a imobilização não deve danificar o tecido. Enquanto a solução de PEG imobilizou o tecido, a resolução e a qualidade das imagens produzidas não foram consistentes. Portanto, os suportes impressos em 3D foram desenvolvidos para imobilizar globos intactos para produzir imagens de maior qualidade com menos risco de danos nos tecidos.

A abordagem
Um suporte impresso em 3D exclusivo foi desenvolvido para imobilizar globos ex vivo intactos para imagens de células vivas. Este suporte evita danos de duas fontes principais: permite a imagem de um globo enucleado sem a necessidade de dissecar a córnea e elimina a exposição à luz UV. Sem essas fontes de danos, as imagens obtidas representaram com mais precisão a resposta às lesões por arranhões feitas experimentalmente. Além disso, o suporte impresso em 3D foi calibrado para as dimensões precisas do olho murino. Isso proporcionou um ajuste muito melhor do que a imobilização na solução PEG, levando a uma imagem de maior qualidade em objetivos de menor potência devido à diminuição do movimento do tecido. Uma barra de cobertura presa à parte superior do suporte garante que o globo permaneça imóvel durante toda a duração do experimento e que não haja deslocamento do globo quando o meio de crescimento é aplicado para manter a hidratação e a viabilidade. A capacidade de imprimir o suporte em dimensões precisas também nos permite gerar um ajuste ideal para olhos murinos de diferentes tamanhos devido à idade ou ao status da doença. Esta tecnologia pode ser aplicada de forma mais ampla para desenvolver suportes para os olhos de diferentes espécies com base em suas dimensões.