使用新型3D打印支架对完整的 离体 地球仪进行活细胞成像
Summary
这项工作描述了一种新的实验方案，该方案利用3D打印支架来实现去核球的高分辨率活细胞成像。通过该协议，可以实时观察离 体 球受伤角膜上皮中的细胞钙信号活性。
Abstract
角膜上皮伤口愈合是由上皮细胞上表达的嘌呤能受体的激活引发的迁移过程。这种激活导致钙动员事件在细胞之间传播，这对于启动细胞运动进入伤口床至关重要，促进有效的伤口愈合。Trinkaus-Randall实验室开发了一种在 离体 鼠球中实时成像角膜伤口愈合反应的方法。这种方法涉及从已按照既定方案安乐死的小鼠身上取出完整的球体，并立即用钙指示剂染料孵育球体。在此阶段可以应用染色细胞其他特征的复染剂，以帮助成像并显示细胞标志。该方案适用于用于复染的几种不同的活细胞染料，包括用于染色肌动蛋白的SiR肌动蛋白和用于染色细胞膜的深红色质膜染色。为了检查对伤口的反应，使用25G针损伤角膜上皮，并将地球仪放置在3D打印支架中。3D打印支架的尺寸经过校准，以确保在整个实验期间地球固定，并且可以修改以适应不同大小的眼睛。随着时间的推移，使用共聚焦显微镜在整个组织的不同深度连续进行伤口反应的活细胞成像。该协议使我们能够在共聚焦显微镜上使用20倍空气物镜生成高分辨率，出版质量的图像。其他目标也可用于此协议。它代表了 离体 鼠球活细胞成像质量的显着提高，并允许识别神经和上皮。
Introduction
角膜
角膜是一种透明的无血管结构，覆盖眼睛前表面，可折射光线以实现视力并保护眼睛内部免受损伤。由于角膜暴露在环境中，它容易受到机械原因（抓挠）和感染的损害。其他方面健康的患者的角膜损伤通常会在 1-3 天内愈合。然而，在患有包括角膜缘干细胞缺乏症和II型糖尿病在内的潜在疾病患者中，角膜伤口愈合过程可以大大延长1。由于角膜是高度神经支配的，这些不愈合的角膜溃疡和复发性角膜糜烂非常痛苦，并大大降低了经历它们的患者的生活质量1。
细胞信号传导
当原本健康的角膜受伤时，伤口附近细胞中的钙信号事件先于并促使细胞迁移到伤口床上，在那里它们闭合损伤而没有疤痕的风险2，3。这些信号传导事件已在使用活细胞成像的角膜上皮细胞培养模型中得到了很好的表征2。初步实验表明，与糖尿病细胞相比，非糖尿病细胞损伤后的钙信号传导明显更多。然而，在 离体 球中表征细胞信号事件已被证明是一项技术挑战。
活细胞成像
以前的研究已经成功地记录了角膜伤口愈合的体外细胞培养模型的钙信号传导事件4，5，6。开发一种方法在离体组织中产生这些信号事件的高质量图像是非常有趣的，因为它将允许在更复杂和逼真的系统中研究这些事件。以前的方法包括解剖角膜，然后固定在紫外线诱导的PEG凝胶7，8，9中。在处理活组织时，固定化是一个重要但具有挑战性的步骤，因为它必须在整个实验过程中保持活力和水合。此外，固定不得损坏组织。虽然PEG溶液固定了组织，但产生的图像的分辨率和质量并不一致。因此，开发了3D打印支架来固定完整的地球仪，以产生更高质量的图像，同时降低组织损伤的风险。
A. 方法
开发了一种独特的3D打印支架，用于固定完整的 离体 地球仪以进行活细胞成像。该支架可防止来自两个主要来源的损坏：它允许对去核眼球进行成像而无需解剖角膜，并且它消除了暴露于紫外线。没有这些损伤源，获得的图像更准确地代表了对实验造成的划痕伤害的反应。此外，3D打印支架被校准到小鼠眼睛的精确尺寸。这提供了比PEG溶液中固定更好的拟合，由于组织运动减少，在低倍物镜下可获得更高质量的图像。固定器顶部的盖杆可确保地球仪在整个实验过程中保持不动，并且在应用生长培养基以保持水合作用和活力时，地球仪不会移位。将支架打印到精确尺寸的能力也使我们能够为由于年龄或疾病状态而不同大小的鼠眼产生最佳贴合度。这项技术可以更广泛地应用于根据不同物种的尺寸开发支架。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了一种活细胞成像技术，该技术使用3D打印支架来稳定和固定完整的动物眼睛。它旨在规避先前离 体 角膜组织活细胞成像方案所识别的几个显着缺点。该协议为完整地球仪的活细胞成像提供了许多优势。它显着减少了不必要的组织损伤，这些损伤可能会干扰对实验诱导的划痕伤口的伤口愈合反应。这包括解剖和暴露于紫外线对神经和上皮的损害。此外，该协议通过固定组织的方…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢NIH的以下赠款支持：RO1EY032079（VTR），R21EY029097-01（VTR），1F30EY033647-01（KS）和5T32GM008541-24（KS）。我们还要感谢马萨诸塞州狮子会眼科研究基金和新英格兰角膜移植基金。
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
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