Oreochromis spp. Çiftliklerinden Türetilen Patojenik Bir Escherichia coli Suşunun Karakterizasyonu Tüm Genom Dizilimini Kullanarak
Summary
Masaüstü cihazları kullanan tüm genom dizileme (WGS) stratejilerinin fizibilitesi, laboratuvar ortamında halk sağlığı ile ilgili her mikrobun genom sorgulamasını basitleştirmiştir. Bakteriyel WGS için iş akışının metodolojik bir uyarlaması tanımlanmıştır ve analiz için bir biyoinformatik boru hattı da sunulmuştur.
Abstract
Su ürünleri yetiştiriciliği, dünya çapında en hızlı büyüyen gıda üreten sektörlerden biridir ve tilapia (Oreochromis spp.) yetiştiriciliği, kültürlenen başlıca tatlı su balığı çeşidini oluşturmaktadır. Su ürünleri yetiştiriciliği uygulamaları antropojenik kaynaklardan kaynaklanan mikrobiyal kontaminasyona duyarlı olduğundan, yaygın antibiyotik kullanımına ihtiyaç duyulmakta ve bu da su ürünleri yetiştiriciliği sistemlerinin Escherichia coli (E. coli) gibi klinik açıdan önemli bir antibiyotiğe dirençli ve patojenik bakteri kaynağı haline gelmesine yol açmaktadır. Burada, iç kesimlerde yetiştirilen Oreochromis spp.’den elde edilen patojenik bir E. coli suşunun antimikrobiyal direnci, virülans ve mobilome özellikleri, tüm genom dizilimi (WGS) ve in silico analizi ile aydınlatılmıştır. Antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) ve WGS yapıldı. Ayrıca, filogenetik grup, serotip, multilokus sekans tiplemesi (MLST), edinilmiş antimikrobiyal direnç, virülans, plazmid ve profaj içeriği mevcut çeşitli web araçları kullanılarak belirlendi. E. coli izolatı sadece ampisilin için orta düzeyde duyarlılık sergiledi ve WGS tabanlı tipleme ile ONT: H21-B1-ST40 suşu olarak karakterize edildi. Sadece tek bir antimikrobiyal dirençle ilişkili gen [mdf(A)] tespit edilmesine rağmen, atipik enteropatojenik E. coli (aEPEC) patotipinden birkaç virülans ilişkili gen (VAG) tanımlanmıştır. Ek olarak, büyük plazmid gruplarından ve profaj ile ilişkili 18 bölgeden plazmid replikonlarının yükü tespit edildi. Sonuç olarak, Meksika’nın Sinaloa kentindeki bir balık çiftliğinden elde edilen bir aEPEC izolatının WGS karakterizasyonu, patojenik potansiyeli ve çiğ su ürünleri tüketmenin olası insan sağlığı riski hakkında bilgi sahibi olmayı sağlar. Çevresel mikroorganizmaları incelemek için yeni nesil dizileme (NGS) tekniklerinden yararlanmak ve sağlık sorunlarının nasıl ortaya çıktığını öğrenmek için tek bir sağlık çerçevesi benimsemek gerekir.
Introduction
Su ürünleri yetiştiriciliği, dünya çapında en hızlı büyüyen gıda üreten sektörlerden biridir ve üretim uygulamaları, insan tüketimi için artan gıda talebini karşılamayı amaçlamaktadır. Küresel su ürünleri yetiştiriciliği üretimi 1997 yılında 34 milyon tondan (Mt) 2017 yılında 112 Mt’ye üç katınaçıkmıştır 1. Üretimin yaklaşık% 75’ine katkıda bulunan ana tür grupları, deniz yosunu, sazan, çift kabuklu, yayın balığı ve tilapia (Oreochromis spp.) 1. Bununla birlikte, mikrobiyal varlıkların neden olduğu hastalıkların ortaya çıkması, yoğun balık yetiştiriciliği nedeniyle kaçınılmazdır ve potansiyel ekonomik kayıplara yol açmaktadır2.
Balık yetiştiriciliği uygulamalarında antibiyotik kullanımı, verimlilikteki ana sınırlayıcı faktör olan bakteriyel enfeksiyonların önlenmesi ve tedavisi için iyi bilinmektedir 3,4. Bununla birlikte, artık antibiyotikler su ürünleri yetiştiriciliği çökeltilerinde ve suda birikir, seçici basınç uygular ve balıklarla ilişkili ve ikamet eden bakteri topluluklarını değiştirir 5,6,7,8. Sonuç olarak, su ürünleri yetiştiriciliği ortamı, antimikrobiyal direnç genleri (ARG’ler) ve çevredeki ortamda antibiyotiğe dirençli bakterilerin (ARB) daha fazla ortaya çıkması ve yayılması için bir rezervuar görevi görür9. Balık yetiştiriciliği uygulamalarını etkileyen yaygın olarak gözlenen bakteriyel patojenlere ek olarak, Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. ve Salmonella spp.10’un insan patojen suşları da dahil olmak üzere Enterobacteriaceae ailesinin üyelerine sıklıkla rastlanmaktadır. E. coli, balık yetiştiriciliğinde balık unu ve sudan izole edilen en yaygın mikroorganizmadır 11,12,13,14,15.
E. coli, memelilerin ve kuşların gastrointestinal sisteminde, bağırsak mikrobiyotalarının kommensal bir üyesi olarak yaşayan çok yönlü bir gram-negatif bakteridir. Bununla birlikte, E. coli, toprak, tortular, yiyecek ve su dahil olmak üzere farklı çevresel nişlerde kolonileşmek ve devam etmek için oldukça uyarlanabilir bir kapasiteye sahiptir16. Yatay gen transferi (HGT) fenomeni yoluyla gen kazancı ve kaybı nedeniyle, E. coli hızla insanlarda ve hayvanlarda geniş bir hastalık spektrumuna neden olabilen, iyi adapte olmuş antibiyotiğe dirençli bir patojene dönüşmüştür17,18. İzolasyon orijinine bağlı olarak, patojenik varyantlar intestinal patojenik E. coli (InPEC) veya ekstraintestinal patojenik E. coli (ExPEC) olarak tanımlanır. Ayrıca, InPEC ve ExPEC, hastalık tezahürüne, genetik arka plana, fenotipik özelliklere ve virülans faktörlerine (VF’ler) göre iyi tanımlanmış patotipler halinde alt sınıflara ayrılmıştır 16,17,19.
Patojenik E. coli suşları için geleneksel kültür ve moleküler teknikler, farklı patotiplerin hızlı bir şekilde tespit edilmesine ve tanımlanmasına izin vermiştir. Bununla birlikte, zaman alıcı, zahmetli olabilirler ve sıklıkla yüksek teknik eğitim gerektirebilirler19. Ayrıca, genetik geçmişlerinin karmaşıklığı nedeniyle E. coli’nin tüm patojenik varyantlarını güvenilir bir şekilde incelemek için tek bir yöntem kullanılamaz. Şu anda, bu dezavantajlar, yüksek verimli dizileme (HTS) teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla aşılmıştır. Tüm genom dizileme (WGS) yaklaşımları ve biyoinformatik araçlar, mikrobiyal DNA’nın araştırılmasını uygun fiyatlı ve büyük ölçekte geliştirerek, yakından ilişkili patojenik varyantlar20,21,22 dahil olmak üzere mikropların tek bir çalışmada derinlemesine karakterizasyonunu kolaylaştırmıştır. Biyolojik sorulara bağlı olarak, veri analizi yapmak için çeşitli biyoinformatik araçları, algoritmalar ve veritabanları kullanılabilir. Örneğin, asıl amaç ARG’lerin, VF’lerin ve plazmidlerin varlığını değerlendirmekse, ResFinder, VirulenceFinder ve PlasmidFinder gibi araçlar, ilişkili veritabanlarıyla birlikte iyi bir başlangıç noktası olabilir. Carriço ve ark.22, ham veri ön işlemeden filogenetik çıkarıma kadar mikrobiyal WGS analizi için uygulanan farklı biyoinformatik yazılımlarına ve ilgili veritabanlarına ayrıntılı bir genel bakış sağlamıştır.
Birçok çalışma, WGS’nin antimikrobiyal direnç özellikleri, patojenik potansiyel ve farklı kökenlerden elde edilen E. coli’nin klinik olarak ilgili varyantlarının ortaya çıkışının ve evrimsel ilişkilerinin izlenmesi ile ilgili genom sorgulaması için geniş yararlılığını göstermiştir23,24,25,26 . WGS, nadir veya karmaşık direnç mekanizmaları da dahil olmak üzere antimikrobiyallere karşı fenotipik direncin altında yatan moleküler mekanizmaların tanımlanmasını sağlamıştır. Bu, edinilmiş ARG varyantlarını, ilaç hedef genlerindeki yeni mutasyonları veya promotör bölgeleri 27,28’i tespit ederek gerçekleşir. Dahası, WGS, bir bakteri suşu29’un direnç fenotipi hakkında önceden bilgi gerektirmeden antimikrobiyal direnç profilleri çıkarma potansiyeli sunar. Alternatif olarak, WGS, hem antimikrobiyal direnç hem de virülans özellikleri taşıyan mobil genetik elementlerin (MGE’ler) karakterizasyonuna izin vermiş ve bu da mevcut patojenlerin bakteriyel genom evrimini yönlendirmiştir. Örneğin, 2011 yılında Alman E. coli salgınının araştırılması sırasında WGS’nin uygulanması, görünüşte yeni bir E. coli patotipinin benzersiz genomik özelliklerinin ortaya çıkarılmasıyla sonuçlandı; İlginç bir şekilde, bu salgın suşları, Shiga toksinini kodlayan profajı enterohemorajik E. coli (EHEC) patotip30’dan alan enteroagregatif E. coli (EAEC) grubundan kaynaklanmıştır.
Bu çalışma, bir tezgah üstü sıralayıcı kullanarak bakteriyel WGS için iş akışının metodolojik bir uyarlamasını sunmaktadır. Ayrıca, ortaya çıkan dizileri analiz etmek ve sınırlı biyoinformatik uzmanlığı olan veya hiç biyoinformatik uzmanlığı olmayan araştırmacıları daha fazla desteklemek için web tabanlı araçlar kullanılarak bir biyoinformatik boru hattı sağlanmaktadır. Açıklanan yöntemler, 2011 yılında Sinaloa, Meksika’daki iç çiftlik Oreochromis spp.’den izole edilen patojenik bir E. coli suşu ACM5’in antimikrobiyal direncinin, virülansının ve mobilome özelliklerinin aydınlatılmasına izin verdi12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, patojenik bir E. coli varyantının genomik karakterizasyonu için bir tezgah üstü sıralayıcı ve bir boru hattı kullanılarak bakteriyel WGS iş akışının bir adaptasyonunu sunmaktadır. Kullanılan dizileme platformuna bağlı olarak, ıslak laboratuvar prosedürleri (bakteri kültürü, gDNA ekstraksiyonu, kütüphane hazırlama ve dizileme) ve dizi analizi için geri dönüş süreleri (TAT’lar), özellikle yavaş büyüyen bakteriler incelenirse değişebilir. Yukarıda açıklanan WG…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
José Antonio Magaña-Lizárraga’ya verilen Doktora bursu için Meksika Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi’ne (İspanyolca’daki kısaltmasıyla CONACyT) [No. 481143].
Materials
| Accublock Mini digital dry bath | Labnet | D0100 | Dry bath for incubation of tubes |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for DNA library purification |
| DeNovix DS-11 | DeNovix Inc. | UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 0030108418 | 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 12321D | Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification |
| Gram-negative Multibac I.D. | Diagnostic reseach (Mexico) | PT-35 | Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing |
| MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) | Illumina | FC-420-1004 | Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150) |
| MiniSeq System Instrument | Illumina | SY-420-1001 | Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing |
| MiniSpin centrifuge | Eppendorf | 5452000816 | Standard centrifuge for tubes |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | Index set A, B, C, D |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | DNA library control for sequencing |
| Precision waterbath | LabCare America | 51221081 | Water bath shaker used for bacterial culture |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q33231 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32866 | Fluorometer used for fluorescence assay |
| Qubit Assay tubes | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32856 | 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A24811 | Thermocycler used for DNA library amplification |
| Spectronic GENESYS 10 Vis | Thermo | 335900 | Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing |
| ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit | Zymo Research Inc. | D4300 | Kit for genomic DNA extraction (50 preps) |
References
- Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
- Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
- Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
- Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
- Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
- Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
- Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
- Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
- Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
- Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
- Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
- Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
- Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
- Liao, C. -. Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
- Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
- Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
- Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
- Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
- Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
- Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
- Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
- Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
- Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
- Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
- Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
- Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
- Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
- Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
- Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
- Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
- . CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018)
- CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021)
- Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
- Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
- Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
- Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
- Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
- Ménard, L. -. P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
- Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
- Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
- Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
- FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016)
- Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).
