체외 기질 스크리닝을 위해 정제된 재조합 초파리 카스파제를 사용한 절단 분석

1. 박테리아에서 재조합 카스파아제 발현 관심 유전자(카스파제 또는 추정 기질)를 표준 프로토콜23을 사용하여 N- 및/또는 C-말단 태그(들)를 갖는 박테리아 발현 벡터로 복제한다.참고: 태그는 재조합 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있으며 재조합 단백질의 정제에 사용됩니다. 여기서, Dronc, Drice, 및 이들의 촉매 돌연변이체는 벡터 pET28a에 클로닝되고, 이는 N-말단 6xHis 태그 (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A)를 제공한다. (입문서 정보는 보충 표 1 참조). 관심 유전자를 갖는 벡터를 표준 절차 23,24를 사용하여 유능한 BL21 (DE3) pLysS E. 대장균 세포로 형질전환시킨다. 형질전환 혼합물을 LB 한천 플레이트에 적절한 항생제(pET28a의 경우 카나마이신)로 플레이팅하여 형질전환 박테리아를 선택합니다. (보충 표 2 참조) 플레이트에서 콜로니를 선택하고 적절한 항생제가 포함된 LB 배지 5mL에 접종하여 진탕 플랫폼에서 220rpm으로 37°C에서 밤새 성장시킵니다. 다음 날, 항생제로 LB 배지 30-50mL(샘플당)를 준비하고 하룻밤 동안 배양한 배양액 1mL를 추가합니다. 바이오 광도계 / 분광 광도계를 사용하는 600 nm (OD600)에서의 광학 밀도는 0.1에서 0.2 사이 여야합니다. 배양물을OD600 이 0.6에 도달할 때까지 진탕 플랫폼 상에서 220 rpm으로 37°C에서 성장시킨다. OD600 이 0.6에 도달할 때까지 매시간 확인하십시오. 약 2-3 시간이 걸립니다. 단백질 (카스파제) 발현을 유도하려면 IPTG를 0.1-0.2mM의 최종 농도로 첨가하십시오 (IPTG 스톡에서 1 : 1,000-1 : 500으로 희석, 보충 표 2 참조). 배양물을 220 rpm에서 30°C에서 3시간 동안 성장시킨다.참고: 시간과 온도는 발현되는 단백질의 종류와 용해도에 따라 다릅니다. 이러한 조건은 다른 카스파제 또는 기질이 표현되는 경우 조정해야 할 수 있습니다. 3시간 후, 배양물을 50mL 원심분리 튜브에서 4°C에서 2,000 x g으로 20분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 버리고 펠릿으로 진행하십시오.참고: 이 시점에서 프로토콜을 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다. 박테리아 펠릿은 -80 °C에서 동결 될 수 있습니다. 2. 소규모 재조합 카스파제 추출 -80°C 보관에서 펠렛화된 배양액과 함께 냉동 튜브를 제거하고 펠릿을 부드럽게 하기 위해 10분 동안 얼음 위에 보관합니다. 10분 후, 1mL 혈청학적 피펫이 있는 피펫 컨트롤러를 사용하여 새로 첨가된 프로테아제 억제제, 10mg/mL의 리소자임 및 50U/mL의 벤조나제가 보충된 0.6mL의 박테리아 세포 용해 완충액(보충 표 2)을 펠릿 함유 튜브에 추가합니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 펠릿 입자가 없는 투명한 옅은 노란색 용액이 보일 때까지 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 용해시킵니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 용해물을 적절한 원심분리 튜브로 옮기고 용해물을 17,000 x g 에서 4°C에서 40분 동안 원심분리합니다. 상청액을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이것은 카스파제를 함유 한 조 추출물입니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 Ni-NTA 아가 로스로 정제를 진행하십시오. 3. 소규모 His-tagged 카스파제 정제 단계 2.5로부터의 카스파아제 추출물의 각 튜브에 Ni-NTA 아가로스의 50% 슬러리 0.2 mL를 첨가한다. 엔드 온 엔드 회전 장치의 튜브를 4 ° C에서 1 시간 동안 회전시킵니다. 1시간 후, 팁이 손상되지 않은 상태에서 Ni-NTA 아가로스가 있는 추출물을 폴리프로필렌 컬럼 1mL에 넣고 랙에 넣습니다. 5 분 동안 그대로 두십시오. 5분 후, 컬럼의 캡을 제거하고 중력 흐름에 의해 상청액이 흘러나오도록 합니다. Ni-NTA 아가로스의 충전된 수지를 방해하지 않고 컬럼에 세척 완충액 1mL(보충 표 2)를 조심스럽게 추가하고 중력 흐름을 통해 세척합니다. 세척 단계를 세 번 수행하십시오. 카스파아제 용리를 위해 세척 버퍼를 완전히 배출한 후 컬럼의 수집 노즐 아래에 1.5mL 미세 원심분리 튜브를 놓습니다. 각 컬럼에 0.5mL의 용출 완충액(사용 직전에 1x 프로테아제 억제제가 보충됨)을 추가하고 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 용출액을 수집합니다.참고: 미세 정제된 용출액은 색상이 투명합니다. 용출액을 얼음 위에 보관하고 Bradford 분석25로 단백질 농도를 측정합니다. 정제된 카스파제의 순도/균질성을 SDS-PAGE로 확인한 후 쿠마시 블루 염색26.참고: 50mL LB 배양의 수율은 카스파아제 단백질 0.5mg에서 1.5mg 사이입니다. 용리에 0.5mL의 용리 완충액이 사용된다는 점을 감안할 때 농도 범위는 1에서 3mg/mL입니다. 이러한 카스파아제 제제가 밤새 활성을 잃기 때문에 용해 및 정제 당일에 시험 관내 절단 분석을 위해 정제된 카스파제 용출액을 사용하는 것이 중요합니다. 4. 무세포 발현 시스템에서 추정 카스파아제 기질의 발현 참고: 이 프로토콜에서 Dronc의 천연 기질인 Drice는 대장균 의 재조합 발현(위의 섹션 3 참조)과 포유류 무세포 발현 시스템인 토끼 망상적혈구 용해물(RRL)에서의 발현에 의해 제조됩니다(이 섹션, 아래 참조). 추정 기질의 유전자를 표준 절차 23을 사용하여 T7,T3 또는 SP6 프로모터 중 어느 하나를 함유하는 발현 벡터 내로 복제한다.참고: 이 프로토콜에서 DriceC211A 는 모델 기질로 사용되고 유전자 발현을 위한 T7 프로모터를 운반하고 면역 블로팅에 의한 검출을 위해 N-말단 Myc-태그로 추정 단백질 기질을 태그하는 벡터 pT7CFE1-N-Myc에 클로닝되었습니다. RRL에서, 후보 기질은 방사성 또는 비방사성으로 합성될 수 있다.비방사성 합성: 0.5mL 미세 원심분리 튜브에 RRL 25μL, 반응 완충액 2μL, 류신 마이너스 아미노산 혼합물 0.5μL(1mM), 아미노산 혼합물-마이너스 메티오닌(1mM), 리보뉴클레아제 억제제 1μL(40U/μL), DNA 주형(0.5μg/μL) 2μL, T7-RNA 폴리머라제 1μL를 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 반응의 최종 부피를 50μL로 조정합니다. 피펫팅을 하거나 피펫 팁으로 교반하여 성분을 부드럽게 혼합하고 잠시 스핀다운합니다.참고: RRL 용해물에는 100-200mg/mL의 내인성 단백질이 포함되어 있습니다. 시험관 내 번역 반응의 경우 RRL을 50% 농도로 추가합니다(여기서는 25μL/50μL 반응). 방사성 합성: 0.5mL 미세원심분리 튜브에 RRL 용해물 25μL, 반응 완충액 2μL, 아미노산 혼합물-마이너스 메티오닌 0.5μL(1mM), 리보뉴클레아제 억제제 1μL(40U/μL), DNA 주형 2μL(0.5μg/μL), S35 표지 메티오닌 2μL(10mCi/mL에서 1000Ci/mmol) 및 T7-RNA 폴리머라제 1μL를 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 반응의 최종 부피를 50μL로 조정합니다. 피펫팅을 하거나 피펫 팁으로 교반하여 성분을 부드럽게 혼합하고 잠시 스핀다운합니다. 팁과 튜브는 방사성 폐기물 용기에 폐기하십시오.참고: 류신 없이 아미노산 혼합물을 첨가하지 마십시오. pT7CFE1 벡터는 단백질 발현을 위해 T7 프로모터를 사용한다. 다른 벡터는 T3 또는 SP6 프로모터를 사용한다. 이 경우 T7 RNA 중합효소 대신 T3 또는 SP6 RNA 중합효소를 사용해야 합니다. DNA 주형이 고순도인지 확인하십시오. 반응물을 30°C에서 90분 동안 인큐베이션한다. 10초 동안 잠깐 돌리고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. RRL에서 추정 기질의 발현 수준을 SDS-PAGE 및 면역블로팅/자가방사선촬영으로 확인합니다.참고: 절단 반응에 첨가되는 RRL 추출물의 양은 검출 방법(면역블로팅 또는 S35 오토라디오그래피)으로 검출할 수 있는 단백질의 양을 기준으로 해야 합니다. 시험관 내 절단 분석(다음 섹션)으로 진행하거나 -80°C에서 보관하십시오. 5. RRL로 생성된 기질 을 사용한 시험관 내 절단 분석 섹션 4에 설명된 대로 생성된 추정 기판을 가져옵니다. 이 프로토콜에서는 N-Myc-DriceC211A 가 모델 기판으로 사용됩니다. 추정 기질의 발현 수준에 따라(면역블롯 또는 자가방사선 촬영 분석에 의해 별도로 결정됨, 단계 4.4 참조), 절단 분석에서 관심 단백질로 프로그래밍된 RRL의 1-10μL를 사용합니다. 섹션 1, 2 및 3에서 생성된 정제된 카스파아제 단백질 10μg을 추가합니다. 카스파아제 분석 완충액으로 총 반응 부피를 50μL로 만듭니다. 반응물을 30°C의 수조에서 3시간 동안 인큐베이션합니다. 절단 분석에 적절한 대조군을 포함해야 합니다. 여기서, 촉매 돌연변이 DroncC318A 가 대조군으로 사용된다. 3 시간 후, 튜브를 얼음 위로 옮겨 반응을 중지하십시오. 50mM DTT를 포함하는 LDS 샘플 버퍼 한 부피를 추가합니다. 반응은 LDS 샘플 완충액의 첨가로 완전히 정지된다. 샘플을 열 블록에서 75°C에서 10분 동안 인큐베이션합니다. 빠르게 회전하고, 플릭으로 혼합하고, 샘플당 24μL를 로드하고, SDS-PAGE를 실행하거나(섹션 7 참조) 샘플을 -20°C에서 보관합니다. 6. 박테리아로 발현된 재조합 기질 단백질을 사용한 시험관 내 절단 분석 10μg의 정제된 후보 기질(여기서는 섹션 1, 2 및 3에서 생성된 6xHis-DriceC211A)을 0.5mL 미세 원심분리 튜브에 추가합니다. 섹션 1 및 2에서 생성된 정제된 카스파아제 단백질 10μg을 추가합니다. 카스파아제 분석 완충액을 사용하여 총 부피를 50μL로 가져옵니다. 5.5-5.9단계를 수행합니다. 7. SDS-PAGE 및 면역 블로팅 절단 반응(24μL)을 4%-12% 트리스-글리신 또는 비스-트리스 그래디언트 겔(재료 표)에 로드하고 단백질 전기영동 및 면역블로팅(또는 S35 표지 기질을 사용하는 경우 자가방사선 촬영)을 수행하여 표준 절차27,28을 사용하여 결과를 시각화합니다.참고: 여기, 이 프로토콜에서, Mops 실행 버퍼 및 LDS 로딩 버퍼가 있는 Bis-Tris 그래디언트 겔이 사용되었습니다. 일반적으로 트리스-글리신 겔의 일반적으로 사용되는 PAGE 프로토콜은 트리스-글리신-SDS 실행 버퍼와 SDS 로딩 버퍼를 사용하여 실행됩니다.