인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

참고: 이 연구에 사용된 hiPSC-CM은 이전에 설명된 hiPSC 배양 및 CM 분화 프로토콜26,27에 따라 생성되었습니다. 선택적으로, hiPSC-CM은 CS 프로토콜(섹션 4)을 시작하기 전에 최근에 게시된 대로 확장 및 냉동 보존될 수 있습니다(섹션 4)10. 1. 세포 배양 배지, 용액 및 분취량의 제조 기초 배지 준비페니실린-스트렙토마이신과 배지(RPMI 1640)를 실온(RT)으로 평형화하고 완전히 해동되었는지 확인합니다. 배지 500mL와 펜/연쇄상 구균 5mL를 섞습니다. 최대 8주 동안 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37°C로 평형을 유지하십시오. RPMI + B27 준비B27 보충제와 기본 배지를 RT로 평형을 이루십시오. 보충제를 완전히 해동하십시오. 기본 배지 490mL와 50x B27 보충제 10mL를 혼합합니다. 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37°C로 평형을 유지하십시오. hiPSC-CM 재도금 매체 준비Rho-연관, 코일 코일 함유 단백질 키나아제(ROCK) 억제제(2μM 최종 농도) 및 10% 녹아웃 혈청 대체물(KSR)을 RPMI + B27 배지에 추가합니다. 필요에 따라 ROCK 억제제를 RM 배지에 직접 추가합니다. 보충된 배양 배지는 보관하지 마십시오. CM 해동 매체 준비1:100 농도의 세포 생존 보충제(예: 레비타셀) 및 20% KSR을 RPMI + B27 배지에 첨가하고 사용하기 전에 37°C로 평형을 이룹니다. 성숙 보충제 준비앞서 기술한 성숙 배지 포뮬러28 은 다음과 같이 구성된다: 3 mM 포도당, 10 mM L-락테이트, 5 mg/mL 비타민 B12, 0.82 mM 비오틴, 5 mM 크레아틴 일수화물, 2 mM 타우린, 2 mM L-카르니틴, 0.5 mM 아스코르브산, 1x NEAA, 0.5% (w/v) 알부맥스, 1x B27, 및 1% KOSR. 성숙 보충제 1병(500mL)을 준비하려면 포도당이 없는 DMEM 병에서 65mL를 제거하고 포도당 2.7g, L-젖산염 5.6g, 비타민 B12 0.025mg, 비오틴 1mg, 크레아틴 일수화물 3.73g, 타우린 1.25g, L-카르니틴 1.975g, 아스코르브산 0.7125g, NEAA 50mL, 알부맥스 12.5g, 페니실린-스트렙토마이신 5mL. 0.22μm 공극 PES(Polyethersulfone) 멤브레인이 있는 멸균 일회용 필터 장치를 통해 필터링합니다. 45mL(500mL의 성숙 배지 준비) 또는 4.5mL(50mL의 성숙 배지 준비)로 분취합니다. 20°C에서 최대 6개월 동안 보관하세요. 성숙 배지 준비RT에서 B27 보충제, 녹아웃 SR, 페니실린-스트렙토마이신, 성숙 보충제28 및 DMEM 무포도당 배지를 평형화합니다. 435mL의 DMEM 무포도당 배지를 10mL의 50x B27 보충제, 5mL의 페니실린-스트렙토마이신, 5mL의 녹아웃 SR 및 45mL의 성숙 보충제와 혼합합니다. 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37 °C에서 평형을 유지하십시오. 형광 밝은 배지 준비페니실린-스트렙토마이신과 DMEM 플루오로브라이트 배지를 RT에서 평형화합니다. 보충제가 완전히 해동되었는지 확인하십시오. 500mL의 DMEM 플루오르브라이트 배지와 5mL의 페니실린-스트렙토마이신을 혼합합니다. 최대 1개월 동안 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37 °C에서 평형을 유지하십시오. 비이온성 세제 용액 준비20% w/v 비이온성 세제 분말(예: F-127)을 PBS와 혼합합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하고 4°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 사용하기 전에 RT에서 평형을 유지하십시오. 칼슘 염료 배지 준비비이온성 세제 용액(최종 농도 0.04% v/v)과 칼슘 염료 0.1배(예: Cal520 AM)를 형광 밝은 매체에 혼합합니다. 50mL 원뿔형 튜브에 Cal520 10μL와 비이온성 세제 용액 20μL를 추가합니다. 완전히 녹을 때까지 섞는다. 세포에 첨가하기 전에 용액을 어둠 속에 보관하십시오. 2. 완충액의 제조 투과화 및 차단 완충액 준비: 이 완충액에는 10mL의 PBS, 5% wt/v BSA 및 0.3% v/v Triton-X-100이 포함되어 있습니다. 유세포 분석 완충액 준비: 이 완충액에는 50mL의 PBS, 1% wt/v BSA 및 0.3% v/v Triton-X-100이 포함되어 있습니다. 유세포 분석 세척 완충액: 이 완충액에는 50mL의 PBS와 1% wt/v BSA가 포함되어 있습니다. 스페로이드 세척 완충액(SWB): 이 완충액에는 1L의 PBS에 1mL의 Triton-X-100, 2mL의 10%(DPBS의 w/v) SDS 및 2g의 BSA가 포함되어 있습니다.알림: SWB는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. 임베딩 용액(ES) 준비: 100mL의 임베딩 용액을 준비하기 위해 50mL의 글리세롤과 9.09mL의 dH 2O, 1mL의 트리스완충액(1M, pH 8.0) 및 200μL의 EDTA(0.5M)를 혼합합니다. 과당 22.7g을 넣고 녹을 때까지 어두운 곳에서 RT에서 혼합하십시오. 투명해지면 과당 22.2g을 넣고 녹을 때까지 섞는다. 그런 다음 요소 15g을 넣고 녹을 때까지 혼합합니다(어두운 곳에서 4°C에서 보관). PBT(PBS with Tween-20) 버퍼를 준비합니다. 이 버퍼에는 PBS/Tween-20(0.1% v/v)이 포함되어 있습니다. PBS 1L에 Tween-20 1mL를 추가합니다. 3. 소분자의 제조 DMSO에서 50μL의 10mM 분취액으로 티아조비빈(ROCK 억제제) 분말을 재구성하고 최대 6개월 동안 -20°C에서 보관합니다. 빛으로부터 보호하십시오. DMSO에서 Cal-520 AM의 각각 10μL의 2.5mM 분취량을 준비하고 최대 6개월 동안 -20°C에서 보관합니다. 빛으로부터 보호하십시오. 4. 심장 스페로이드 생성 참고: 더 많은 양의 CS의 경우 2mL의 hiPSC-CM 재도금 매체가 있는 6웰 초저 부착 플레이트에 최대 100만 CM을 시드합니다. 이 연구는 96웰 플레이트의 웰당 최소 2,500(2.5k CS)에서 최대 20,000(20k CS)의 hiPSC-CM을 사용했습니다. 하나의 96웰 플레이트에 대해 최소 2 x 106 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)10을 포함하는 세포 배양물을 준비합니다. 배양된 hiPSC-CM이 합류점에 도달하면 0.1mL/cm2 의 멸균 심장 박리 용액(예: tryple)을 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 15분 동안 인큐베이션합니다. 5mL 피펫을 사용하여 2mL의 따뜻한 기본 배지로 플러싱하여 세포를 기계적으로 해리하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 명시야 현미경(4배 배율)으로 분리를 확인합니다. 세포는 흰색으로 보이고 둥근 모양입니다. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 1mL의 hiPSC-CM 재도금 배지에 세포를 재현탁합니다. 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 세포 펠릿을 기계적으로 해리합니다. 용액은 3 회 또는 4 회 혼합 후 균질하게 나타납니다. 세포를 세십시오. 적절한 양의 세포를 100 μL의 재도금 배지에 각각 초저부착 둥근 바닥 96웰 웰로 옮긴다. 인큐베이터에서 70 rpm의 궤도 쉐이커에 CS의 플레이트를 24 시간 동안 놓습니다. 인큐베이터 조건을 37°C, 5% CO2, 21%O2 및 90% 습도로 설정합니다. 각 웰에서 50μL의 배지를 흡인하고 처음 48시간 동안 웰당 100μL의 RPMI + B27 배지를 추가합니다.알림: 우발적인 흡인 및 스페로이드 파열을 방지하기 위해 항상 50μL의 배지를 96웰 플레이트에 보관하십시오. 각 웰에서 배지 100μL를 흡인하고 웰당 성숙 배지 100μL를 추가합니다. 성숙 배지에서 세포를 유지하고 2-3 일마다 배지를 새로 고칩니다. 5. CS의 냉동 보존 알림: CS는 장기 보관을 위해 냉동 보존할 수 있습니다. 냉동보존은 CSs 생성 후 3일째부터 수행할 수 있습니다. CS는 96웰 플레이트의 웰에서 직접 또는 극저온 이온의 CS 현탁액으로 냉동보존할 수 있습니다. 접시를 얼음 위에 10분 동안 올려 접시를 미리 식힙니다. 스페로이드 플레이트를 70 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 50 μL가 남을 때까지 상청액을 제거하고 웰당 200 μL의 얼음처럼 차가운 hiPSC 동결 배지를 추가합니다.알림: 시술의 전체 기간 동안 CS 서스펜션을 얼음 위에 두십시오. 스페로이드가 있는 6웰 플레이트의 경우 500μL 동결 배지 cryovial에서 하나의 웰을 동결합니다. 플레이트 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.알림: 96웰 플레이트는 폴리스티렌 상자에 보관해야 하며, 사용할 수 없는 경우 5.5.1단계에 설명된 대로 실리콘 몰드를 만들 수 있습니다. 웰 플레이트와 냉동실 사이의 균일한 열 교환을 보장하려면 플레이트를 폴리스티렌 상자나 실리콘 몰드에 조심스럽게 넣습니다.실리콘 몰드를 준비하려면: 실리콘 엘라스토머 키트의 두 구성 요소를 10:1 비율로 세게 혼합합니다. 진공 펌프를 사용하여 15-20분 동안 용액의 기포를 제거합니다. 이어서, 웰 플레이트의 바닥 부분 내부에 용액을 던지고 진공 펌프를 사용하여 10분 동안 기포를 제거합니다. 몰드를 오븐에 넣고 60°C에서 8시간 동안 경화시켜 플레이트에서 벗겨지는 반가요성 엘라스토머를 얻습니다. 플레이트를 -80°C에서 폴리스티렌 상자 또는 준비된 실리콘 몰드에서 최소 4시간 동안 동결합니다. 장기간 보관을 위해 플레이트를 액체 질소 탱크 또는 -150°C 냉동고로 옮깁니다. 6. 심장 스페로이드의 해동 알림: 빠른 해동 과정을 위해 한 번에 두 개 이상의 플레이트를 해동하지 마십시오. 50mL 원뿔형 튜브에 37°C로 예열된 기본 배지 20mL를 준비합니다. 액체 질소에서 CS가 있는 세포 플레이트를 수집하고 15분 동안 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이터 조건을 37°C, 5% CO2, 21%O2 및 90% 습도로 설정합니다. 상청액 및 세포 펠릿을 제거하고, 따뜻한 기저 배지에서 각 웰을 재현탁시킨다. 웰당 200 μL의 배지를 사용합니다. 70 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 6.3단계와 6.4단계를 반복합니다. 세포 펠릿이 남을 때까지 상청액을 제거하고 각 웰에 CM 해동 배지 200μL를 추가합니다. 24 시간 동안 인큐베이터에서 70rpm으로 궤도 셰이커에 CS의 플레이트를 놓습니다. 인큐베이터 조건을 37°C, 5% CO2, 21%O2 및 90% 습도로 설정합니다. 각 웰에서 배지 50μL를 흡인하고 처음 48시간 동안 웰당 RPMI + B27 배지 100μL를 추가합니다. 각 웰에서 배지 100μL를 흡인하고 웰당 성숙 배지 100μL를 추가합니다. 성숙 배지에서 세포를 유지하고 2-3 일마다 배지를 새로 고칩니다. 7. 세포내Ca2+ 일시적인 현상의 평가 참고: CS는 총 3주 동안 배양됩니다. 냉동 2주 전, 해동 1주 후. ‘신선한’ 컨트롤은 연령에 맞게 조정됩니다. 배양 1주일 후, 해동된 CS는 칼슘 취급 광학 이미징에 최적입니다. 칼슘 염료(예: Cal520AM)를 사용하여 세포에서Ca2+ 의 흡수 및 방출을 평가합니다. 웰당 칼슘 염료 배지 100μL로 처리하고 인큐베이터에서 60분 동안 배양합니다. 인큐베이터 조건을 37°C, 5% CO2, 21%O2 및 90% 습도로 설정합니다.알림: Cal520AM은 빛에 민감합니다. 어둠 속에서 모든 로딩 절차와 실험을 수행하십시오. 칼슘 획득 및 분석 시스템을 준비합니다.현미경에 전원을 공급하여 환경 제어 옵션이 켜져 있는지 확인합니다. 카메라와 프레이밍 조리개 크기를 조정하여 배경 영역을 최소화합니다.참고: 여기서는 라이카 썬더 DMi8 현미경을 사용했습니다. 다른 현미경 시스템도 30FPS(프레임/초) 이상의 샘플링 속도를 허용할 때까지 적용할 수 있습니다. 10초 이내에 2-10개의 피크가 일정하게 흐르는 비디오를 녹화하고 96웰 플레이트를 스캔하여 처음에는 왼쪽으로 이동한 다음 지그재그 방식으로 아래쪽으로 이동하여 전체 플레이트를 덮습니다. 488 nm 레이저를 사용하여 칼슘 신호를 측정하고; 칼슘 방출 중에 밝은 녹색 신호가 있는 검은색 배경으로 대비를 설정합니다. 일시적인Ca2+ 를 획득한 후, 형광 추적 분석 소프트웨어(예를 들어, CyteSeer, Vala Sciences)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 데이터를 분석한다. 8. 해리된 심장 스페로이드의 유세포 분석 참고: 이 연구에서는 해동 과정 전후에 CS의 생존력을 결정하기 위해 유세포 분석을 사용했습니다. 스페로이드 손상을 방지하기 위해 5mL 피펫을 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 CS를 수집하고 70 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 PBS 1mL를 추가합니다. 200 x g에서 3분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 1mL의 심장 박리 용액(예: tryple)을 추가하여 CS를 해리합니다. 튜브를 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 5mL 피펫을 사용하여 현미경으로 관찰할 때 단일 세포를 볼 수 있을 때까지 2mL의 기본 배지로 플러싱하여 세포를 기계적으로 해리합니다. 200 x g에서 3분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 1x PBS에 200μL의 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 CM을 고정합니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오. 200 x g에서 3분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 PBS 1mL를 추가합니다.알림: 일시 중지 지점: 고정된 hiPSC-CM은 최대 4주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 세포 현탁액을 FACS 튜브로 옮기고 200 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 50μL의 투과화 완충액에 1 x 105 세포를 재현탁합니다. 세포를 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 면역형광 유세포 분석을 위해 8.9.1-8.9.4단계를 수행합니다.α-액티닌 항체가 포함된 유세포 분석 완충액(50μL)에 세포를 1:300의 희석액으로 재현탁합니다. 또 다른 FACS 튜브에서, 각각의 이소타입 대조군 (예를 들어, FITC 마우스 IgM, κ 이소타입 [1:200 희석])과 함께 유세포 분석 완충액 (50 μL) 중에 1 x 105 세포를 재현탁한다. 유사하게, 음성 대조군을 위해 50 μL의 유세포 분석 완충액에 1 x 105 세포를 재현탁합니다. 세포를 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 2.5 mL의 유세포 분석 완충액을 첨가하고, 세포를 4°C에서 3분 동안 200 x g 에서 원심분리하고; 상층액을 버리고 이 세척 단계를 두 번 반복합니다. 50μL의 유세포 분석 완충액에 세포를 2차 항체 염소 항-마우스(1:300 희석)로 재현탁합니다.참고: 2차 항체 용액은 빛에 민감하므로 튜브를 어두운 곳에 두십시오. 요오드화 프로피듐(PI)으로 생존력을 검사하려면 시료당 150μL의 PI(1:1,000)를 추가하고 15분 동안 배양합니다.알림: PI 용액은 빛에 민감하므로 튜브를 어두운 곳에 두십시오. 보충 그림 1에 표시된 대로 표준 게이팅 전략에 따라 게이트를 조정하고 유세포 분석기로 세포를 분석합니다. 9. 전체 3D 스페로이드의 면역형광 염색 참고: 이 프로토콜은 이전에 발표된29 및 심장 스페로이드에 맞게 조정된 면역형광 표지 시 전체 오가노이드의 고해상도 3D 이미징을 위한 프로토콜을 기반으로 합니다. 절차 중에 모든 피펫 팁과 원뿔형 튜브는 스페로이드가 플라스틱에 달라붙는 것을 방지하기 위해 1% wt/v BSA-PBS로 코팅할 수 있습니다. 재료를 코팅하려면 1% BSA-PBS에 담그십시오. 5mL 피펫을 사용하여 스페로이드가 손상되지 않도록 주의하여 기계적 중단을 방지하십시오. 5mL 피펫이 있는 15mL 코팅 튜브에 CS를 수집합니다. 스페로이드는 눈으로 볼 수 있습니다. 항체 조합당 ~20-50개의 스페로이드를 수집합니다. 70 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1x PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액 1mL에 스페로이드를 조심스럽게 재현탁합니다. 4°C에서 45분 동안 고정합니다. 20분 후 코팅된 1mL 팁을 사용하여 스페로이드를 부드럽게 재현탁합니다. 이것은 모든 스페로이드 사이에 균일한 고정을 제공합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 10mL를 튜브에 넣고 튜브를 뒤집어 부드럽게 섞습니다. 4°C에서 10분 동안 배양하고 70 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다.알림: 이 단계부터는 고정 후 CS가 팁에 달라붙지 않기 때문에 일반적으로 팁과 원추형 튜브의 코팅이 필요하지 않습니다. 펠렛을 얼음처럼 차가운 SWB(웰당 SWB 200μL)에 재현탁하여 CS를 차단하고 스페로이드를 24웰 현탁 배양 플레이트로 옮깁니다.참고: 하나의 큰 펠릿의 CS를 여러 웰로 분할하여 다양한 염색을 수행할 수 있습니다. 항체 조합 당 ~ 20-50 CS를 사용하십시오. 4°C에서 최소 15분 동안 배양합니다. 빈 웰에 SWB 200μL를 추가하여 참조 웰로 사용합니다.참고: 면역형광 염색의 경우 48웰 또는 96웰 플레이트를 사용하여 항체 사용량을 줄일 수도 있습니다. 그러나, 염색 및 세척 결과는 웰 당 더 작은 부피로 인해 감소될 수 있다. 플레이트를 45분 동안 5° 각도로 기울인 상태로 두어 스페로이드가 플레이트 바닥에 안착되도록 합니다. SWB를 제거하고 CS를 SWB 200μL에 남겨 둡니다(기준 웰을 사용하여 최소 부피 200μL를 추정). 1차 항체(예: ɑ-액티닌[1:200] 및 트로포닌 T[1:200])와 함께 SWB 200μL를 추가하고 흔들거나 흔들면서 4°C에서 밤새 배양합니다(수평 셰이커에서 40rpm). 다음날 SWB 1mL를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 45분 동안 5° 각도로 그대로 두어 스페로이드가 플레이트 바닥에 가라앉도록 합니다. SWB를 제거하고 플레이트에 200μL를 남깁니다. SWB 1mL를 넣고 천천히 흔들거나 흔들면서 2시간 동안 세척합니다. 9.12단계와 9.13단계를 두 번 더 반복합니다. 플레이트를 45분 동안 5°로 기울인 상태로 두어 CS가 플레이트 바닥에 안착되도록 합니다. SWB를 제거하고 각 웰에 200μL를 남깁니다 SWB 200μL에 2차 항체, 접합 항체 및 염료 2배 농축(예: DAPI[1μg/mL], mouse-AF488[1:500], rabbit-AF568[1:500])을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 다음 날 9.12단계와 9.13단계를 두 번 더 반복합니다. CS를 1.5mL 튜브에 조심스럽게 옮기고 70 x g 에서 3분 동안 회전합니다. CS를 방해하지 않고 피펫팅을 통해 SWB를 최대한 많이 제거합니다. 끝이 잘린 상태에서 200μL 팁을 사용하여 임베딩 용액(ES, RT에서 최소 50μL)을 추가하고 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 다시 현탁하고 RT에서 20분 동안 배양합니다. 그 동안 매니큐어 또는 실리콘 실런트로 유리 슬라이드에 정사각형 용기를 만듭니다. 200μL 팁의 끝을 잘라내고 ES의 CS를 정사각형 용기의 중앙으로 옮깁니다. 그 위에 정사각형 커버슬립을 놓습니다. 기포를 줄이려면 커버슬립의 한쪽을 먼저 놓은 다음 표면 아래에 공기가 갇히지 않을 때까지 커버슬립을 한쪽에서 다른 쪽으로 천천히 내린 다음 커버슬립을 분리합니다. 커버슬립의 모든 가장자리를 부드럽게 눌러 매니큐어나 실리콘 실런트에 밀봉합니다. RT에서 밤새 슬라이드를 그대로 두십시오. 다음 날, 슬라이드는 이미징 준비가 완료됩니다.알림: ES에 의한 광학 제거는 경미한 조직 수축을 유발할 수 있습니다. 그러나 이것은 CS의 전체 형태에 영향을 줄 수 없습니다. 염색 절차는 슬라이드를 4°C(최소 1주일 동안) 또는 -20°C(최소 6개월 동안)에서 보관하여 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.