Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

La curvatura della membrana è un parametro fisico critico di una cellula che si verifica in una varietà di processi cellulari come la morfogenesi, la divisione cellulare e la migrazione cellulare¹. È ampiamente riconosciuto ora che la curvatura della membrana è al di là di un semplice risultato di eventi cellulari; Invece, è emerso come un efficace regolatore delle interazioni proteiche e della segnalazione intracellulare. Ad esempio, è stato scoperto che diverse proteine coinvolte nell’endocitosi mediata da clatrina si legano preferenzialmente alla membrana curva, con conseguente formazione di un hotspot per l’endocitosi². Ci sono molte cause diverse di deformazione della membrana come l’attrazione della membrana da parte delle forze citoscheletriche, la presenza di asimmetria lipidica con gruppi di testa di dimensioni diverse, l’esistenza di proteine transmembrana con forma conica, l’accumulo di proteine che modellano la membrana come le proteine del dominio BAR (dal nome delle proteine Bin, anfifisina e Rvs) e l’inserimento del dominio delle eliche anfipatiche nella membrana¹ . È interessante notare che queste proteine e lipidi non solo deformano la membrana, ma possono anche percepire la curvatura della membrana e mostrare un accumulo preferenziale¹. Pertanto, è fondamentale studiare se e come membrane con diverse curvature alterano la distribuzione e la dinamica delle proteine e dei lipidi ad esse collegati e i potenziali impatti sui relativi processi intracellulari.

Molte tecniche sono state sviluppate per analizzare l’interazione tra membrana curva e proteine sia in cellule vive che in sistemi in vitro. Il sistema di cellule vive fornisce un ambiente cellulare reale con una ricca diversità lipidica e regolazione dinamica della segnalazione proteica 2,3,4,5,6,7. Tuttavia, un sistema così sofisticato è difficile da studiare a causa delle incertezze e delle fluttuazioni nell’ambiente intracellulare. Quindi, i saggi in vitro che utilizzano una membrana artificiale composta da specie lipidiche note e proteine purificate sono diventati potenti sistemi di ricostituzione per caratterizzare la relazione tra proteine e membrane curve. Tradizionalmente, liposomi di diversi diametri sono generati per estrusione per rilevare proteine sensibili alla curvatura tramite un saggio di co-sedimentazione utilizzando la forza centrifuga o un saggio di co-flottazione con un gradiente di densità per evitare l’aggregazione proteica ^8,9. Tuttavia, la curvatura dei liposomi estrusi è limitata dalla dimensione dei pori disponibile del filtro a membrana utilizzato nell’estrusore¹⁰. È stato dimostrato che il test di curvatura a liposoma singolo (SLiC) supera questa limitazione, in cui i liposomi con diametri diversi sono marcati con fluorescenza e immobilizzati sulla superficie in modo che la curvatura possa essere contrassegnata dall’intensità fluorescente¹¹. Tuttavia, è stata osservata una forte variabilità nella composizione lipidica nelle piccole vescicole, che influisce sull’accuratezza della misurazione della curvatura¹². Gli esperimenti di tirare il tethering forniscono una misurazione più accurata della curvatura sul cavo transitorio tirato da vescicole unilamellari giganti (GUV) utilizzando una pinzetta ottica, dove la curvatura può essere ben controllata dalla tensione della membrana generata^13,14. Questo metodo è adatto per studiare proteine sensibili a curvatura positiva o negativa, ma è limitato dal throughput della generazione del tubo¹⁰. Il test SMrT (Supported Membrane Tubes) consente la generazione simultanea di più tubi a membrana che vengono estrusi dallo stesso serbatoio lipidico mediante flussi microfluidici. Tuttavia, la curvatura della membrana varia intrinsecamente lungo il nanotubo, il che compromette l’accuratezza della misurazione della curvatura basata sull’intensità di fluorescenza^15,16. In confronto, l’utilizzo di piccole vescicole unilamellari (SUV, diametro <100 nm¹⁷) per formare un doppio strato lipidico supportato (SLB) su superfici contenenti topografie progettate ha generato una singola membrana a doppio strato con curvature predeterminate da nanofabbricazione o nanomateriali in alta precisione^18,19,20.

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione dell’SLB su superfici di nanochip fabbricate con array di nanobar e come può essere utilizzato per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in vitro. Come mostrato in Figura 1, ci sono sei componenti essenziali del test: A) Pulizia e assemblaggio del chip con una camera microfluidica; B) Preparazione di SUV con composizione lipidica definita; C) Formazione dell’SLB su un nanochip e legame con proteine sensibili alla curvatura; D) Imaging e caratterizzazione delle proteine SLB e curvature sensibili al microscopio a fluorescenza; E) Pulizia del chip per il riutilizzo; F) Elaborazione di immagini per l’analisi quantitativa della capacità di rilevamento della curvatura proteica. Il protocollo dettagliato è descritto passo dopo passo di seguito.