인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석
Summary
이 프로토콜은 시험관 내 실험을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 미세 아교 세포와 같은 세포로의 분화 과정을 설명합니다. 또한 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 체외 식균 작용 분석의 기질로 사용할 수 있는 iPSC 유래 하부 운동 뉴런에서 인간 시냅토솜을 생성하는 자세한 절차도 포함되어 있습니다.
Abstract
미세아교세포는 뇌 미세 환경에서 항상성을 유지하고 여러 신경계 질환의 핵심 역할을 하는 골수성 기원의 상주 면역 세포입니다. 건강과 질병에서 인간 미세아교세포를 연구하는 것은 인간 세포의 공급이 극히 제한되어 있기 때문에 어려운 일입니다. 인간 개체에서 유래 한 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)는이 장벽을 우회하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 시험관 내 실험을 위해 인간 iPSC를 미세아교세포 유사 세포(iMG)로 분화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 iMG는 미세아교세포와 유사한 형태, 적절한 마커의 발현 및 활성 식균작용을 포함하여 미세아교세포의 예상 및 생리학적 특성을 나타냅니다. 추가적으로, 인간 iPSC 유래 하부 운동 뉴런(i3LMN)으로부터 유래된 시냅토좀 기질을 분리하고 표지하기 위한 문서가 제공된다. 살아있는 세포, 종단 영상 분석은 pH에 민감한 염료로 표지 된 인간 시냅 토좀의 삼킴을 모니터링하는 데 사용되어 iMG의 식세포 능력을 조사 할 수 있습니다. 본원에 기술된 프로토콜은 인간 미세아교세포 생물학 및 질병에 대한 미세아교세포의 기여를 조사하는 상이한 분야에 광범위하게 적용가능하다.
Introduction
미세아교세포는 중추신경계(CNS)에 상주하는 면역 세포이며 CNS 발달에 중요한 역할을 합니다. 미세 아교 세포는 항상성을 유지하고 외상 및 질병 과정에 적극적으로 반응하기 위해 성인 뇌에서도 중요합니다. 누적 증거에 따르면 미세아교세포는 여러 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환의 발병 기전에 주요 기여를 합니다1,2. 미세아교세포 생물학에 대한 현재의 지식은 주로 마우스 모델에서 파생되었지만 최근 연구에서는 쥐와 인간 미세아교세포 사이의 중요한 차이점을 밝혀냈으며 인간 미세아교세포의 유전학 및 생물학적 기능을 연구하기 위한 기술 개발의 필요성을 강조했습니다.3,4. 해부된 1차 조직으로부터 미세아교세포를 분리하면 미세아교세포 특성5이 심각하게 변형될 수 있으며, 잠재적으로 그러한 세포로 얻은 결과를 교란시킬 수 있다. 이 방법의 전반적인 목표는 인간 iPSC를 iMG로 분화하여 기저 조건에서 인간 미세아교세포를 연구하기 위한 세포 배양 시스템을 제공하는 것입니다. 또한, 완전 인간 모델 시스템을 사용하는 식작용 분석은 품질 관리 측정으로서 및 질병의 맥락에서 iMG 기능 장애를 평가하기 위한 수단으로서 본 명세서에 포함된다.
iPSC로부터 미세아교세포 분화를 위한 다수의 프로토콜이 최근 문헌 6,7,8,9,10에 등장하였다. 일부 프로토콜의 잠재적 단점은 연장된 또는 장기간의 분화, 다중 성장 인자의 추가, 및/또는 복잡한 실험 절차(6,9,10)를 포함한다. 여기에서 iPSC를 원시 대식세포 전구체(PMP)라고 하는 전구체 세포로 분화하여 미세아교세포 개체 발생의 측면을 요약하는 “사용자 친화적인” 분화 방법이 입증되었습니다7,11. PMP는 이전에 설명된 대로 생성되며, 일부 최적화는 여기에 제시되어 있습니다12. PMP는 MYB 비의존적 난황낭 유래 대식세포를 모방하며, 이는 혈액-뇌 장벽 폐쇄 전에 뇌를 침범하여 배아 발달 동안 미세아교세포를 생성합니다13. PMP를 iMG로 최종 차별화하기 위해 Haenseler et al. 및 Brownjohn et al.의 프로토콜을 기반으로 하는 빠르고 단순화된 단일 배양 방법을 사용했으며, iMG가 미세아교세포가 풍부한 마커 7,8을 강력하게 발현하는 효율적인 미세아교세포 분화 방법을 생성하기 위해 일부 수정했습니다. 이 분화 방법은 iPSC 배양에 대한 전문 지식과 인간 모델 시스템을 사용하여 미세아교세포 생물학을 연구하는 것을 목표로 하는 연구 목표를 가진 실험실에서 재현할 수 있습니다.
iPSC 유래 미세아교세포는 시험관 내 실험을 위한 생물학적으로 관련된 인간 미세아교세포 공급원을 나타내며 식균작용을 포함한 미세아교세포 표준 기능을 조사하는 중요한 도구입니다. 미세아교세포는 뇌와 CNS의 전문 식세포로, 세포 파편, 응집된 단백질 및 분해된 미엘린14를 제거합니다. 미세아교세포는 또한 시냅스를 삼켜 시냅스 리모델링과 병원균의 식균작용을 통한 외부 감염에 대한 방어기능을 합니다 15,16. 이 프로토콜에서 iMG에 의한 식균 작용은 iMG 삼키기위한 재료로 인간 시냅 토좀을 사용하여 평가됩니다. 이를 위해, 인간i3LMNs로부터 유래된 시냅토좀을 단리하기 위한 설명이 기술된다. i3LMN-유래된 인간 시냅토좀은 pH에 민감한 염료로 표지되어 시험관 내에서 포식체 처리 및 분해 중에 산성 구획 내에 국한된 시냅토좀의 정량화를 가능하게 한다. 생세포 현미경을 사용한 식균 작용 분석은 미세아교세포 삼킴의 동적 과정을 실시간으로 모니터링하기 위해 표시됩니다. 이 기능 분석은 완전한 인간 시스템을 사용하여 건강 및 질병에서 소교 세포 식균 작용의 가능한 결함을 조사하기위한 기초를 설정합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 분화 프로토콜은 ~6-8주 내에 iPSC 유래 미세아교세포 유사 세포를 고순도로 충분한 수율로 얻을 수 있는 효율적인 방법을 제공하여 면역형광 실험 및 더 많은 수의 세포가 필요한 기타 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 1주일 동안 최대 1× 10,6개의 iMG를 산출하여 단백질 및 RNA 추출 및 해당 다운스트림 분석(예: RNASeq, qRT-PCR, 웨스턴 블롯, 질량 분석법)을 가능하게 합?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 운동 뉴런 분화를 위한 WTC11 hNIL iPSC 라인을 제공한 마이클 워드와 미세아교세포 분화에 사용되는 KOLF2.1J WT 클론 B03 iPSC 라인을 공급한 잭슨 연구소에 감사를 표합니다. 또한 프로토콜 구현 과정에서 도움을 준 도로시 샤퍼, 생세포 이미징 시스템에 도움을 준 앤서니 지암페트루치와 존 랜더스, 개정 기간 동안 기술적 기여를 해준 헤이든 갓, 이 연구에서 협력한 조나단 정에게 감사드립니다. 이 연구는 UMASS Chan Medical School과 Angel Fund, Inc.의 Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience Fund의 지원을 받았습니다.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
