강변 거대 무척추 동물의 군집 크기 구조를 결정하기위한 자동 이미지 처리
Summary
이 기사는 반자동 이미징 절차를 사용하여 저서 강 거대 무척추 동물에 해당하는 디지털화 된 물체를 스캔, 감지, 정렬 및 식별하는 적응 된 프로토콜의 생성을 기반으로합니다. 이 절차를 통해 약 1 시간 내에 거대 무척추 동물 군집의 개별 크기 분포 및 크기 메트릭을 획득 할 수 있습니다.
Abstract
신체 크기는 자연 공동체에서 섭동의 영향을 평가하기위한 생물학적 지표로 사용될 수있는 중요한 기능적 특성입니다. 공동체 크기 구조는 분류군과 생태계 전반에 걸친 인위적 섭동을 포함하여 생물학적 및 비 생물 적 구배에 반응합니다. 그러나 저서 거대 무척추 동물과 같은 작은 몸체의 유기체 (예 : >500 μm에서 수 센티미터 길이)의 수동 측정은 시간이 많이 걸립니다. 공동체 규모 구조의 추정을 촉진하기 위해 여기에서는 담수 생태계의 생태 상태를 평가하는 데 가장 일반적으로 사용되는 생물학적 지표 중 하나 인 보존 된 강 거대 무척추 동물의 개별 신체 크기를 반자동으로 측정하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 물 샘플용으로 설계된 스캐닝 시스템으로 해양 메조동물성 플랑크톤을 스캔하기 위해 개발된 기존 방법론에서 채택되었습니다. 프로토콜은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다 : (1) 강 거대 무척추 동물의 하위 샘플 (미세하고 거친 샘플 크기 분율)을 스캔하고 디지털화 된 이미지를 처리하여 각 이미지에서 감지 된 각 물체를 개별화합니다. (2) 인공 지능을 통해 학습 세트를 생성, 평가 및 검증하여 스캔 된 샘플의 찌꺼기 및 인공물로부터 거대 무척추 동물의 개별 이미지를 반자동으로 분리합니다. (3) 거대 무척추 동물 군집의 크기 구조를 묘사합니다. 프로토콜 외에도 이 작업에는 보정 결과가 포함되며 거대 무척추 동물 샘플에 절차를 적용하고 추가 개선을 고려하기 위한 몇 가지 과제와 권장 사항을 열거합니다. 전반적으로이 결과는 강 거대 무척추 동물의 자동 신체 크기 측정을위한 제시된 스캐닝 시스템의 사용을 뒷받침하며 크기 스펙트럼의 묘사가 담수 생태계의 신속한 생물학적 평가를위한 귀중한 도구임을 시사합니다.
Introduction
저서 거대 무척추 동물은 수역의 생태 상태를 결정하기위한 생물학적 지표로 널리 사용됩니다1. 거대 무척추 동물 군집을 설명하는 대부분의 지표는 분류 학적 메트릭에 중점을 둡니다. 그러나 신체 크기를 통합하는 새로운 생물학적 평가 도구는 분류 학적 접근법 2,3에 대한 대안 또는 보완적인 관점을 제공하는 것이 좋습니다.
신체 크기는 신진 대사, 성장, 호흡 및 운동과 같은 다른 중요한 특성과 관련된 메타 특성으로 간주됩니다4. 또한, 신체 크기는 영양 위치와 상호 작용을 결정할 수 있습니다5. 공동체의 크기 등급에 의한 개별 신체 크기와 정규화 된 바이오 매스 (또는 풍부) 사이의 관계는 크기 스펙트럼6 으로 정의되며 개별 크기가 로그 스케일7에서 증가함에 따라 정규화 된 바이오 매스의 선형 감소의 일반적인 패턴을 따릅니다. 이 선형 관계의 기울기는 이론적으로 광범위하게 연구되어 왔으며 생태계 전반에 걸친 경험적 연구는이를 공동체 규모 구조의 생태 학적 지표로 사용했습니다4. 생물 다양성 – 생태계 기능 연구에서 성공적으로 사용 된 공동체 크기 구조의 또 다른 합성 지표는 공동체 크기 다양성이며, 이는 크기 스펙트럼 또는 그 유사체의 크기 등급의 섀넌 지수로 표현되며, 이는 개별 크기 분포8를 기반으로 계산됩니다.
담수 생태계에서 서로 다른 동물 그룹의 크기 구조는 환경 구배 9,10,11 및 인위적 섭동 12,13,14,15,16에 대한 생물 공동체의 반응을 평가하기위한 운동 실조 지표로 사용됩니다. 거대 무척추 동물도 예외는 아니며, 그 크기 구조는 환경 변화17,18 및 채광 19, 토지 이용 20 또는 질소 (N) 및 인 (P) 농축20,21,22와 같은 인위적 섭동에도 반응합니다. 그러나 커뮤니티 규모 구조를 설명하기 위해 수백 명의 개인을 측정하는 것은 지루하고 시간이 많이 소요되는 작업이며 시간 부족으로 인해 실험실에서 일상적인 측정으로 피하는 경우가 많습니다. 따라서, 표본을 분류하고 측정하기 위한 여러 반자동 또는 자동 이미징 방법이 개발되었다 23,24,25,26. 그러나 이러한 방법의 대부분은 유기체의 개별 크기보다 분류 학적 분류에 중점을두고 있으며 모든 종류의 거대 무척추 동물에 사용할 준비가되어 있지 않습니다. 해양 플랑크톤 생태학에서, 스캐닝 이미지 분석 시스템은 동물성 플랑크톤 군집27,28,29,30,31의 크기 및 분류 학적 구성을 결정하기 위해 광범위하게 사용되었다. 이 기기는 전 세계 여러 해양 연구소에서 찾을 수 있으며 보존된 동물성 플랑크톤 샘플을 스캔하여 전체 샘플의 고해상도 디지털 이미지를 얻는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 새로운 장치를 만드는 데 투자하지 않고 강에서 거대 무척추 동물 군집 크기 스펙트럼을 신속하게 자동 추정하기 위해이 기기의 사용을 조정합니다.
프로토콜은 샘플을 스캔하고 전체 이미지를 처리하여 샘플에 있는 물체의 단일 이미지(즉, 비네트)를 자동으로 얻는 것으로 구성됩니다. 모양, 크기 및 그레이 레벨 피처의 여러 측정값은 각 개체의 특성을 지정하고 개체를 범주로 자동 분류한 다음 전문가가 검증할 수 있도록 합니다. 각 유기체의 개별 크기는 픽셀 단위로 측정 된 유기체의 면적에서 파생 된 타원체 생물량 (mm3)을 사용하여 계산됩니다. 이를 통해 샘플의 크기 스펙트럼을 신속하게 얻을 수 있습니다. 우리가 아는 한,이 스캐닝 이미징 시스템은 메조 동물성 플랑크톤 샘플을 처리하는 데만 사용되었지만이 장치는 잠재적으로 담수 저서 거대 무척추 동물과 함께 작업 할 수 있습니다.
따라서이 연구의 전반적인 목표는 이전에 해양 메조 동물성 플랑크톤 27,32,33과 함께 사용 된 기존 프로토콜을 적용하여 보존 된 강 거대 무척추 동물의 개별 크기를 신속하게 얻는 방법을 도입하는 것입니다. 절차는 물 샘플을 스캔하기 위해 스캐닝 장치와 스캔한 이미지를 처리하기 위한 3개의 개방형 소프트웨어로 작동하는 반자동 접근 방식을 사용하는 것으로 구성됩니다. 커뮤니티 크기 구조 및 관련 크기 메트릭을 자동으로 획득하기 위해 디지털화된 강 거대 무척추동물을 스캔, 감지 및 식별하는 적응된 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 효율성을 높이기위한 절차 및 지침에 대한 평가는 북동부 (NE) 이베리아 반도 (Ter, Segre-Ebre 및 Besòs)의 3 개 분지에서 수집 한 강변 거대 무척추 동물 샘플의 42 스캔 이미지를 기반으로 제공됩니다.
샘플은 스페인 정부 100의 건너 가능한 강에서 저서 강 거대 무척추 동물의 현장 샘플링 및 실험실 분석을위한 프로토콜에 따라34m 강 뻗기에서 수집되었습니다. 샘플은 다중 서식지 조사 후 서버 샘플러(프레임: 0.3m x 0.3m, 메쉬: 250μm)로 수집되었습니다. 실험실에서 샘플을 5mm 및 500μm 메쉬를 통해 세척하고 체질하여 두 개의 하위 샘플을 얻었습니다 : 거친 하위 샘플 (5mm 메쉬)과 미세 하위 샘플 (500μm 메쉬), 별도의 바이알에 보관하고 70 % 에탄올에 보존했습니다. 샘플을 두 개의 크기 분수로 분리하면 큰 유기체가 작은 유기체보다 희귀하고 적기 때문에 군집 크기 구조를 더 잘 추정할 수 있습니다. 그렇지 않으면 스캔된 샘플은 큰 크기 분율의 편향된 표현을 갖습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
강변 거대 무척추 동물에 대한 Gorsky et al. 2010에 의해 설명 된 방법론의 적용은 담수 거대 무척추 동물의 공동체 크기 구조를 추정 할 때 높은 분류 정확도를 허용합니다. 결과는 프로토콜이 샘플에서 개별 크기 구조를 추정하는 시간을 약 1시간으로 줄일 수 있음을 시사합니다. 따라서, 제안 된 프로토콜은 담수 생태계에서 섭동의 영향을 평가하기위한 빠르고 통합 된 생물학적 지표로서 거대 무척…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 스페인 과학 혁신 및 대학부(보조금 번호 RTI2018-095363-B-I00)의 지원을 받았습니다. CERM-UVic-UCC 회원인 Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach 및 Núria Sellarès에게 거대 무척추동물 현장 샘플링 및 실험실 분류 작업과 샘플 스캐닝에 협력한 David Albesa에게 감사드립니다. 마지막으로 Josep Maria Gili와 Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC)에 실험실 시설 및 스캐너 장치 사용에 감사드립니다.
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
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