河川大型無脊椎動物の群集サイズ構造を決定するための自動画像処理
Summary
この記事は、半自動イメージング手順を使用して、底生河川大型無脊椎動物に対応するデジタル化されたオブジェクトをスキャン、検出、分類、および識別するための適応プロトコルの作成に基づいています。この手順により、大型無脊椎動物群集の個々のサイズ分布およびサイズメトリックを約1時間で取得できます。
Abstract
体の大きさは、自然界における摂動の影響を評価するための生物指標として使用できる重要な機能的形質です。群集サイズ構造は、分類群や生態系全体の人為的摂動を含む生物的および非生物的勾配に応答します。しかし、底生大型無脊椎動物などの小体生物(例えば、>500μmから数センチメートルの長さ)の手動測定には時間がかかります。群集サイズの推定を促進するために、ここでは、淡水生態系の生態学的状態を評価するために最も一般的に使用される生物指標の1つである、保存された河川大型無脊椎動物の個々の体のサイズを半自動で測定するプロトコルを開発しました。このプロトコルは、水サンプル用に設計されたスキャンシステムで海洋中動物プランクトンをスキャンするために開発された既存の方法論から適応されています。プロトコルは3つの主要なステップで構成されています:(1)河川大型無脊椎動物のサブサンプル(細かいサンプルサイズと粗いサンプルサイズの割合)をスキャンし、デジタル化された画像を処理して、各画像で検出された各オブジェクトを個別化します。(2)人工知能を通じて学習セットを作成、評価、および検証して、スキャンされたサンプルの残骸やアーティファクトから大型無脊椎動物の個々の画像を半自動的に分離する。(3)大型無脊椎動物群集のサイズ構造を描く。プロトコルに加えて、この作業にはキャリブレーション結果が含まれ、手順を大型無脊椎動物のサンプルに適合させ、さらなる改善を検討するためのいくつかの課題と推奨事項が列挙されています。全体として、結果は、河川大型無脊椎動物の自動体サイズ測定のための提示されたスキャンシステムの使用を支持し、それらのサイズスペクトルの描写が淡水生態系の迅速な生物評価のための貴重なツールであることを示唆しています。
Introduction
底生大型無脊椎動物は、水域の生態学的状態を決定するための生物指標として広く使用されています1。大型無脊椎動物のコミュニティを説明するためのほとんどの指標は、分類学的指標に焦点を当てています。ただし、体のサイズを統合する新しいバイオアセスメントツールは、分類学的アプローチの代替的または補完的な視点を提供することが奨励されています2,3。
体のサイズは、代謝、成長、呼吸、運動などの他の重要な特性に関連するメタ特性と見なされます4。さらに、体の大きさは栄養の位置と相互作用を決定することができます5。個々の体のサイズとコミュニティのサイズクラスによる正規化バイオマス(または存在量)との関係は、サイズスペクトル6 として定義され、対数スケール7で個々のサイズが増加するにつれて正規化バイオマスの線形減少の一般的なパターンに従います。この線形関係の傾きは理論的に広く研究されており、生態系を横断する実証研究はそれを群集サイズ構造の生態学的指標として使用してきました4。生物多様性生態系機能研究において首尾よく使用されている群集サイズ構造の別の合成指標は、個々のサイズ分布に基づいて計算されるサイズスペクトルまたはその類似体のサイズクラスのシャノン指数として表される群集サイズの多様性である8。
淡水生態系では、さまざまな動物群のサイズ構造が運動失調指標として使用され、環境勾配9,10,11および人為的摂動12,13,14,15,16に対する生物群集の応答を評価します。大型無脊椎動物も例外ではなく、そのサイズ構造は環境変化17,18や、鉱業19、土地利用20、窒素(N)とリン(P)濃縮20,21,22などの人為的摂動にも反応します。ただし、コミュニティのサイズ構造を説明するために数百人の個人を測定することは、退屈で時間のかかる作業であり、時間がないため、ラボでの日常的な測定として避けられることがよくあります。したがって、標本を分類および測定するためのいくつかの半自動または自動イメージング方法が開発されている23、24、25、26。ただし、これらの方法のほとんどは、生物の個々のサイズよりも分類学的分類に焦点を当てており、あらゆる種類の大型無脊椎動物に使用する準備ができているわけではありません。海洋プランクトン生態学では、動物プランクトン群集のサイズと分類学的構成を決定するために、走査画像解析システムが広く使用されています27,28,29,30,31。この装置は、世界中のいくつかの海洋研究所で見つけることができ、保存された動物プランクトンサンプルをスキャンして、サンプル全体の高解像度デジタル画像を取得するために使用されます。本プロトコルは、新しい装置の作成に投資することなく、河川における大型無脊椎動物群集サイズスペクトルを迅速に自動的に推定するために、この装置の使用を適応させる。
このプロトコルは、サンプルをスキャンし、画像全体を処理して、サンプル内のオブジェクトの単一の画像(つまり、ビネット)を自動的に取得することで構成されます。形状、サイズ、グレーレベルの特徴のいくつかの測定値が各オブジェクトを特徴付け、オブジェクトをカテゴリに自動的に分類し、専門家によって検証されます。各生物の個体サイズは、ピクセル単位で測定された生物の面積から導出される楕円体バイオボリューム(mm3)を使用して計算されます。これにより、試料のサイズスペクトルを迅速に得ることができる。私たちの知る限り、このスキャンイメージングシステムは中部動物プランクトンサンプルの処理にのみ使用されていますが、このデバイスは淡水底生大型無脊椎動物での作業を可能にする可能性があります。
したがって、この研究の全体的な目標は、海洋中動物プランクトン27,32,33で以前に使用されていた既存のプロトコルを適応させることにより、保存された河川大型無脊椎動物の個体サイズを迅速に取得する方法を導入することです。この手順は、スキャン装置で動作する半自動アプローチを使用して水サンプルをスキャンし、3つのオープンソフトウェアを使用してスキャンされた画像を処理することで構成されます。群集サイズ構造および関連するサイズメトリクスを自動的に取得するために、デジタル化された河川大型無脊椎動物をスキャン、検出、および識別するための適応されたプロトコルが本明細書に提示される。効率を高めるための手順とガイドラインの評価は、北東(NE)イベリア半島の3つの流域(テル、セグレエブレ、ベソス)から収集された河川大型無脊椎動物サンプルの42のスキャン画像に基づいて提示されます。
サンプルは、スペイン政府からの手頃な価格の河川の底生河川大型無脊椎動物の野外サンプリングと実験室分析のプロトコルに従って、100 mの川域で収集されました34。サンプルは、マルチハビタット調査の後、サーバーサンプラー(フレーム:0.3 m x 0.3 m、メッシュ:250 μm)で収集されました。実験室では、サンプルを洗浄し、5 mmと500 μmのメッシュでふるいにかけ、粗いサブサンプル(5 mmメッシュ)と細かいサブサンプル(500 μmメッシュ)の2つのサブサンプルを取得し、別々のバイアルに保存し、70%エタノールで保存しました。サンプルを2つのサイズ画分に分離すると、大きな生物は小さな生物よりも希少で少ないため、コミュニティのサイズ構造をより適切に推定できます。それ以外の場合、スキャンされたサンプルは、大きなサイズの割合の偏った表現を持ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
Gorsky et al. 2010によって記述された方法論を河川大型無脊椎動物に適応させることで、淡水大型無脊椎動物の群集サイズ構造を推定する際の高い分類精度が可能になります。結果は、プロトコルがサンプル中の個々のサイズ構造を推定する時間を約1時間に短縮できることを示唆しています。したがって、提案されたプロトコルは、淡水生態系における摂動の影響を評価するための高速で統合的…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スペイン科学イノベーション大学省(助成金番号RTI2018-095363-B-I00)の支援を受けました。CERM-UVic-UCCのメンバーであるエリア・ブレチャ、アンナ・コスタローザ、ライア・ヒメネス、マリア・イザベル・ゴンザレス、マルタ・ユトグラール、フランチェスク・ラック、ヌリア・セラレスには、大型無脊椎動物のフィールドサンプリングと実験室での選別に協力し、デビッド・アルベサにはサンプルスキャンに協力してもらいました。最後に、ジョセップ・マリア・ギリとマール科学研究所(ICM-CSIC)に、実験施設とスキャナー装置の使用に感謝します。
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
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