Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, enfeksiyon sırasında ve doku hasarı ve homeostazdaki değişiklikler gibi steril uyaranlara yanıt olarak ilk savunma hattı olarak işlev görür. Hücre yüzeyindeki ve sitoplazmadaki doğuştan gelen bağışıklık sensörleri, enflamatuar sinyal yollarını ve hücresel yanıtları tetiklemek için patojen veya hasarla ilişkili moleküler paternlere (sırasıyla PAMP’ler veya DAMP’ler) yanıt verir. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin kilit süreçlerinden biri, enfekte olmuş veya hasarlı hücreleri çıkarmak ve daha fazla doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini yönlendirmek için hücre ölümünün indüklenmesidir. Programlanmış hücre ölümü (PCD), türler arasında oldukça korunmuş bir süreçtir ve doğuştan gelen bir bağışıklık mekanizması olarak evrimsel önemini vurgulamaktadır.

Tüm hücre tiplerinde aktive edilebilen birkaç doğuştan gelen immün PCD yolu vardır. Kaspazlar, geleneksel olarak enflamatuar olmayan apoptoz yolunun yanı sıra pirotoz, nekroptoz ve PANoptosis 1,2,3,4,5 gibi enflamatuar PCD yolları da dahil olmak üzere birçok PCD yolunda kritik olan, yüksek oranda korunmuş, hücre içi^, sistein bağımlı proteazların önemli bir ailesidir. . İyi tanımlanmış 11 insan ve 10 murin kaspazı ve fonksiyonel olabilen psödo-kaspazlar vardır ve çoğu aktivasyon için bölünme gerektiren inaktif monomerik veya dimerik pro-kaspazlar olarak yapısal olarak ifade edilir ^6,7. Kaspazlar ayrıca multiprotein komplekslerinin işe alınması ve oluşumu için önemli alanlar içerir. Bunlar arasında kaspaz-1, kaspaz-2, kaspaz-4, kaspaz-5, kaspaz-9 ve kaspaz-11’de bulunabilen kaspaz aktivasyon ve işe alım alanı (CARD) veya kaspaz-8 ve kaspaz-10’da bulunan ölüm efektör alanı (DED) bulunur. Hem proteolitik aktiviteleri hem de multiprotein kompleksleri oluşturma yetenekleri sayesinde, kaspazlar doğuştan gelen immün PCD’nin kritik itici güçleridir.

Doğuştan gelen immün PCD’de kaspazların rolü ilk olarak apoptozda tanımlanmıştır; burada başlatıcı kaspazlar, kaspaz-2, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10, cellat kaspazları, kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7’yi aktive ederek^hücre ölümünü ^8,9,10,11,12 olarak yönlendirmiştir. Başlatıcı kaspazlar çeşitli sinyal kaskadları ile aktive edilebilir; ekstrinsik yolak, hücre dışı ligandın neden olduğu ölüm reseptörü sinyallemesi yoluyla kaspaz-8’i aktive eder ve intrinsik yolak, mitokondriyal bütünlüğün bozulması yoluyla kaspaz-9’u aktive eder¹³. Aktif başlatıcı kaspazlar, aktif formlarını üretmek için cellat kaspazlarının büyük ve küçük katalitik alt birimlerini ayıran bağlayıcıyı ayırır. Cellat, daha sonra hücreyi parçalamak için substratlarını parçalara ayırır, bu da DNA bozulmasına, zar ağartmasına, nükleer parçalanmaya ve apoptotik cisimlerin salınmasına neden olur^14,15. Bu süreç tipik olarak, ölmekte olan hücrelerin efferositoz¹⁶ ile derhal temizlenmesiyle birleştiğinde, litik olmayan ve enflamatuar olmayan bir hücre ölümü formunda sona erer. Bununla birlikte, efferositozdaki kusurlar veya fagositik hücrelerin eksikliği, apoptotik hücrelerin birikmesine neden olabilir ve bu da daha sonra litik ve enflamatuar hücre ölümüne maruz kalır^17,18.

Kaspaz-1 (insan ve fare), kaspaz-4 ve kaspaz-5 (insan) ve kaspaz-11 (fare) dahil olmak üzere enflamatuar kaspazların, pirotoz adı verilen bir inflamatuar doğuştan gelen immün PCD (iii-PCD) formu sırasında aktive olduğu keşfedilmiştir. Kaspaz-1 aktivasyonu, sitozolik doğuştan gelen bir bağışıklık sensörü, bir adaptör molekülü (bir CARD [ASC] içeren apoptozla ilişkili leke benzeri protein) ve kaspaz-1 içeren multiprotein kompleksleri olan enflamatuarların oluşumu ile ilişkilidir. Bu kompleksin oluşumu, kaspaz-1’in aktif formunu serbest bırakmak için yakınlık aracılı otoproteolize maruz kalmasına izin verir, bu da pro-inflamatuar sitokinler interlökin (IL)-1β ve IL-18 ve gözenek oluşturan molekül gasdermin D (GSDMD) 19,20,21,22,23 dahil olmak üzere hedef substratları parçalayabilir. . Kaspaz-11, kaspaz-4 ve kaspaz-5, lipopolisakkarit (LPS) ^19,20 gibi PAMP’leri algıladıktan sonra enflamatuarın yukarı akış oluşumu olmadan GSDMD’yi aktive edebilir. Bu kaspazlar dimerizasyona uğrar, ardından oligomerizasyon ve sitozolik LPS’ye bağlandıktan sonra aktivasyon için kendi kendine bölünmeye uğrar, bu da IL-1β ve IL-18 olgunlaşmasını indüklemek için kanonik olmayan enflamatuar aktivasyon^24,25,26 ve hücreye özgü bir şekilde kaspaz-1 aktivasyonuna yol açar ²⁰. Bu pro-inflamatuar sitokinlerin olgunlaşması ve salınması, bu kaspazları “enflamatuar” olarak karakterize eder. Ek olarak, apoptotik kaspaz-8’in enflamatuar lokalize olduğu ve apoptotik ve piroptotik süreçler arasında bir bağlantı sağladığı bulunmuştur. Çalışmalar, apoptotik kaspaz-8’in nekroptoz adı verilen başka bir PCD formunu düzenlemek için de kritik olduğunu bulmuştur. Kaspaz-8 kaybı, nekrotozun III-PCD yolunu ^{27,28,29,30,31,32,33,34,35} yönlendirmek için spontan reseptör ile etkileşime giren serin-treonin kinaz 3 (RIPK3) aracılı karışık soy kinaz etki alanı benzeri psödokinaz (MLKL) aktivasyonu ile sonuçlanır.

Kaspazlar tarihsel olarak başlattıkları hücre ölümünün türüne göre “apoptotik” veya “enflamatuar” olarak sınıflandırılmış olsa da, artan kanıtlar, doğuştan gelen immün PCD yolları arasında kaspazlar ^3,4 yoluyla kapsamlı bir çapraz konuşma olduğunu göstermektedir. Örneğin, enflamatuarlardan gelen inflamatuar kaspaz-1, apoptotik kaspaz-7’yi kanonik aktivasyon bölgesi^34’te ayırır. Kaspaz-1 aktivasyonu ayrıca poli (ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP1) ³⁶ gibi apoptotik substratların bölünmesine de yol açabilir. GSDMD’den yoksun hücrelerde, kaspaz-1 ayrıca kaspaz-3 ^37,38’i de parçalayabilir. Ek olarak, kanonik olarak apoptotik kaspaz-3, PCD^17,18’i indüklemek için gasdermin E’yi (GSDME) parçalayabilir ve ayrıca GSDM’yi inaktif bir form^40’a işleyebilir. Ayrıca, enflamatuar komplekse kaspaz-8 alımı 39,40,41,42,43,44,45 olarak gözlemlenmiştir ve kaspaz-8^, kanonik ve kanonik olmayan enflamatuar aktivasyonun önemli bir düzenleyicisidir³⁹. Birçok enflamatuar durumda kaspaz-8 ve kaspaz-1 için örtüşen ve gereksiz roller de vardır ve piroptotik, apoptotik ve nekroptetik bileşenlerin aktivasyonu ile karakterize doğuştan gelen immün PCD, hastalık spektrumunda 39,46,47,48,49,50 oranında ortaya çıkar.

Enflamatuar ve apoptotik kaspazlar arasındaki bu çapraz konuşmaya dayanarak, doğuştan gelen bağışıklık ve PCD’nin mekanik anlayışında önemli bir boşluk tespit edildi ve PANoptozun keşfine yol açtı. PANoptoz, patojenlere, PAMP’lara, DAMP’lere ve homeostazdaki değişikliklere yanıt olarak aktive olan ve PANoptozomlar tarafından düzenlenen benzersiz bir III-PCD şeklidir – diğer hücre ölüm yollarından bileşenleri entegre eden çok yönlü makromoleküler kompleksler 44,50,51,52,53,54,55 . PANoptozdaki biyolojik etkilerin toplamı tek başına piroptoz, apoptoz veya nekroptoz ile tek başına 3,4,35,36,39,46,47,48 ile açıklanamaz, çünkü PANoptoz^, kaspaz-1, kaspaz-11, kaspaz-8, kaspaz-9^, kaspaz-3 ve / veya kaspaz-7 dahil olmak üzere çoklu kaspazların aktivasyonu ile karakterize edilir. bağlama bağlı olarak 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptoz, bulaşıcı ve enflamatuar hastalıkların yanı sıra kanserler ve kanser tedavilerinde giderek daha fazla rol oynamaktadır 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Apoptoz, piroptoz, nekroptoz ve PANoptoz dahil olmak üzere hücre ölüm yolakları boyunca kaspazların temel rolü göz önüne alındığında, aktivasyonlarını karakterize etmek ve PCD yollarının tam karmaşıklığını anlamak için teknikler geliştirmek önemlidir. Buradaki protokol, hücreleri uyarmak ve kaspazların sonraki aktivasyonunu ölçmek için bir yöntemi detaylandırmaktadır (Şekil 1). Bu yöntem, genellikle aktivasyonları için gerekli olan kaspazların proteolitik bölünmesini, onları incelemek için bir araç olarak kullanır. Batı lekelenmesi yoluyla, protein boyutları belirlenebilir, bu da inaktif pro-kaspazların ve bunların aktif, parçalanmış formlarının net bir şekilde görselleştirilmesine ve farklılaştırılmasına izin verir.

Bu protokolün başlıca avantajları, 1) PCD aktivasyonunu daha doğru bir şekilde belirlemek için tek bir endojen hücre popülasyonundan paralel olarak çoklu kaspazların aktivasyonunu değerlendirme yeteneği ve 2) kapsamlı eğitim veya pahalı ekipman gerektirmeyen nispeten basit laboratuvar tekniklerinin kullanılmasıdır. Önceki protokoller, kültür süpernatantlarında, hücre ve doku lizatlarında, mikroskopi yoluyla tüm hücrelerde ve in vivo ^{67,68,69,70,71’de} kaspaz aktivasyonunu izlemek için batı lekeleme, floresan muhabirleri veya antikor boyama yöntemini kullanmıştır^, ancak bu teknikler genellikle bir numunede sadece bir veya iki kaspazı izler. Ayrıca, bölünme üzerine floresan kaspaz bölünme bölgeleri içeren sentetik peptit substratları^{, hücre} veya doku lizatlarında kaspaz aktivasyonunu izlemek için kullanılmış olsa da, bu substratlar genellikle birden fazla kaspaz tarafından parçalanabilir ve bu da bu sistemdeki bireysel kaspazların spesifik aktivasyonunu belirlemeyi zorlaştırır. Ek olarak, floresan muhabirlerin veya diğer etiket tabanlı yöntemlerin kullanımı yerine batı lekelenmesinin kullanılması, araştırmacıların muhabir genleriyle spesifik hücre çizgileri oluşturmak yerine endojen hücreleri kullanmalarına izin verir. Endojen hücrelerin kullanılmasının, birçok ölümsüzleştirilmiş hücre çizgisinin anahtar hücre ölüm molekülleri^72,73’te eksik olması da dahil olmak üzere sonuçları etkileyebilecek birçok avantajı vardır. Ek olarak, endojen hücrelerin kullanılması, tek bir soy yerine makrofajlar, epitel hücreleri ve endotel hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerinin değerlendirilmesine izin verir. Batı lekelemesi aynı zamanda büyük, pahalı ekipmanlara veya karmaşık kurulumlara ihtiyaç duymadan dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlarda gerçekleştirilebilen nispeten basit ve uygun maliyetli bir tekniktir.

Bu protokol, diğer enflamatuar sinyal yolaklarındaki iskele rolleri ve işlevleri de dahil olmak üzere kaspazların hem hücre ölümüne bağımlı hem de hücre ölümünden bağımsız işlevlerini anlamak için biyoloji genelinde yaygın olarak uygulanabilir⁷⁴. Bu yöntemin uygulanması, doğuştan gelen immün PCD yolaklarının ve hastalıklar ve koşullar arasında enflamatuar sinyalleşmenin incelenmesinde birleşik bir yaklaşıma izin verir ve bu protokol, gelecekteki terapötik stratejilerin gelişimini bilgilendirecek kritik düzenleyici süreçleri ve mekanik bağlantıları tanımlamak için kullanılabilir.