Оценка активации каспазы для оценки гибели врожденных иммунных клеток

Врожденная иммунная система действует как первая линия защиты во время инфекции и в ответ на стерильные раздражители, такие как повреждение тканей и изменения гомеостаза. Врожденные иммунные датчики на поверхности клетки и в цитоплазме реагируют на молекулярные паттерны, связанные с патогеном или повреждением (PAMP или DAMP, соответственно), чтобы вызвать воспалительные сигнальные пути и клеточные реакции. Одним из ключевых процессов врожденного иммунного ответа является индукция гибели клеток для удаления инфицированных или поврежденных клеток и стимулирования дальнейших врожденных и адаптивных иммунных реакций. Запрограммированная гибель клеток (PCD) является высококонсервативным процессом у разных видов, что подчеркивает его эволюционное значение как врожденного иммунного механизма.

Существует несколько врожденных иммунных путей PCD, которые могут быть активированы во всех типах клеток. Каспазы являются ключевым семейством высококонсервативных, внутриклеточных, цистеин-зависимых протеаз, которые имеют решающее значение для многих путей ПХД, включая традиционно невоспалительный путь апоптоза, а также воспалительные пути ПХД, такие как пироптоз, некроптоз и ПАНоптоз 1,2,3,4,5 . Существует 11 каспаз человека и 10 мышиных каспаз, которые хорошо определены, а также псевдокаспазы, которые могут быть функциональными, и большинство из них конститутивно экспрессируются в виде неактивных мономерных или димерных прокаспаз, которые требуют расщепления для активации ^6,7. Каспазы также содержат важные домены для рекрутирования и образования мультибелковых комплексов. К ним относятся домен активации и рекрутирования каспазы (CARD), который можно найти в каспазе-1, каспазе-2, каспазе-4, каспазе-5, каспазе-9 и каспазе-11, или эффекторный домен смерти (DED), который обнаружен в каспазе-8 и каспазе-10. Благодаря своей протеолитической активности и способности образовывать мультибелковые комплексы, каспазы являются критическими драйверами врожденного иммунного PCD.

Роль каспаз во врожденном иммунном PCD была впервые определена при апоптозе, где инициирующие каспазы, каспазы-2, каспазы-8, каспазы-9 и каспазы-10, активируют каспазы-палача, каспазу-3, каспазу-6 и каспазу-7, чтобы вызвать гибель клеток 8,9,10,11,12. Инициирующие каспазы могут активироваться различными сигнальными каскадами; Внешний путь активирует каспазу-8 посредством передачи сигналов рецептора смерти, индуцированного внеклеточным лигандом, а внутренний путь активирует каспазу-9 через нарушение целостности митохондрий¹³. Активированные инициирующие каспазы расщепляют линкер, разделяющий большие и малые каталитические субъединицы каспаз палачей, с образованием их активных форм. Затем каспазы палача расщепляют свои субстраты, чтобы разобрать клетку, что приводит к деградации ДНК, блеббингу мембраны, фрагментации ядра и высвобождению апоптотических тел^14,15. Этот процесс обычно заканчивается нелитической и невоспалительной формой гибели клеток в сочетании с немедленным клиренсом умирающих клеток путем эффероцитоза¹⁶. Однако дефекты эффероцитоза или недостаток фагоцитарных клеток могут привести к накоплению апоптотических клеток, которые затем подвергаются литической и воспалительной гибели^{клеток 17,18}.

Было обнаружено, что воспалительные каспазы, включая каспазу-1 (человека и мышь), каспазу-4 и каспазу-5 (человека) и каспазу-11 (мышь), активируются во время формы воспалительного врожденного иммунного ПХД (III-PCD), называемого пироптозом. Активация каспазы-1 связана с образованием воспалений, которые представляют собой мультибелковые комплексы, содержащие цитозольный врожденный иммунный сенсор, молекулу-адаптер (связанный с апоптозом пятнистый белок, содержащий CARD [ASC]) и каспазу-1. Образование этого комплекса позволяет каспазе-1 подвергаться аутопротеолизу, опосредованному близостью, для высвобождения своей активной формы, которая может расщеплять целевые субстраты, включая провоспалительные цитокины интерлейкин (IL)-1β и IL-18 и порообразующую молекулу гасдермин D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Каспаза-11, каспаза-4 и каспаза-5 также могут активировать GSDMD без образования воспаления после обнаружения PAMP, таких как липополисахарид (LPS)^19,20. Эти каспазы подвергаются димеризации с последующей олигомеризацией и саморасщеплением для активации при связывании с цитозольным ЛПС, что приводит к неканонической активации воспаления 24,25,26 и активации каспазы-1 присущим клетке образом, чтобы индуцировать созревание IL-1β и IL-18 ²⁰. Созревание и высвобождение этих провоспалительных цитокинов характеризуют эти каспазы как «воспалительные». Кроме того, было обнаружено, что апоптотическая каспаза-8 локализуется в воспалении, обеспечивая связь между апоптотическими и пироптотическими процессами. Исследования показали, что апоптотическая каспаза-8 также имеет решающее значение для регуляции другой формы ПМД, называемой некроптозом. Потеря каспазы-8 приводит к спонтанной активации серин-треонинкиназы 3 (RIPK3), опосредованной рецепторами, опосредованной доменной псевдокиназой смешанной линии (MLKL), чтобы управлять путем III-PCD некроптоза 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

В то время как каспазы исторически классифицировались как «апопптические» или «воспалительные» в зависимости от типа гибели клеток, которую они инициируют, растущие данные свидетельствуют о том, что существует обширное перекрестное взаимодействие между врожденными иммунными путями PCD через каспазы ^3,4. Например, воспалительная каспаза-1 из инфламмасом расщепляет апоптотическую каспазу-7 в ее каноническом месте^{активации 34}. Активация каспазы-1 также может приводить к расщеплению апоптотических субстратов, таких как поли(АДФ-рибоза)полимераза 1 (PARP1)³⁶. В клетках, лишенных GSDMD, каспаза-1 также может расщеплять каспазу-3^37,38. Кроме того, канонически апоптотическая каспаза-3 может расщеплять гасдермин Е (GSDME) для индуцирования PCD^17,18, а также перерабатывать GSDMD в неактивную форму⁴⁰. Кроме того, наблюдалось рекрутирование каспазы-8 в воспалительный комплекс 39,40,41,42,43,44,45^, а каспаза-8 является ключевым регулятором канонической и неканонической активации воспаления ³⁹. Существуют также перекрывающиеся и избыточные роли каспазы-8 и каспазы-1 во многих воспалительных состояниях, а врожденный иммунный PCD, характеризующийся активацией пироптотических, апоптотических и некроптотических компонентов, встречается по всему спектру заболевания ^{39,46,47,48,49,50}.

На основе этих перекрестных помех между воспалительными и апоптотическими каспазами был выявлен ключевой пробел в механистическом понимании врожденного иммунитета и PCD, что привело к открытию PANoptosis. PANoptosis – это уникальная форма III-PCD, которая активируется в ответ на патогены, PAMP, DAMP и изменения гомеостаза и регулируется PANoptosomes – многогранными макромолекулярными комплексами, которые интегрируют компоненты из других путей гибели клеток 44,50,51,52,53,54,55 . Совокупность биологических эффектов при ПАНоптозе не может быть индивидуально объяснена только пироптозом, апоптозом или некроптозом 3,4,35,36,39,46,47,48, поскольку ПАНоптоз характеризуется активацией множественных каспаз, включая каспазу-1, каспазу-11, каспазу-8, каспазу-9, каспазу-3 и/или каспазу-7^, в зависимости от контекста 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . Паноптоз все чаще участвует в инфекционных и воспалительных заболеваниях, а также в раке и терапии рака 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66^.

Учитывая существенную роль каспаз в путях гибели клеток, в том числе в апоптозе, пироптозе, некроптозе и паноптозе, важно разработать методы для характеристики их активации и понимания всей сложности путей ПХД. В протоколе подробно описан метод стимуляции клеток и измерения последующей активации каспаз (рис. 1). Этот метод использует протеолитическое расщепление каспаз, которое обычно требуется для их активации, в качестве средства их изучения. С помощью вестерн-блоттинга можно определить размеры белков, что позволяет четко визуализировать и дифференцировать неактивные прокаспазы и их активированные, расщепленные формы.

Основными преимуществами этого протокола являются: 1) его способность оценивать активацию нескольких каспаз параллельно из одной популяции эндогенных клеток для более точного определения активации ПМД и 2) использование относительно простых лабораторных методов, не требующих обширной подготовки или дорогостоящего оборудования. Предыдущие протоколы использовали вестерн-блоттинг, флуоресцентные репортеры или окрашивание антител для мониторинга активации каспазы в культуральных супернатантах, клеточных и тканевых лизатах, целых клетках с помощью микроскопии и in vivo 67,68,69,70,71^, но эти методы обычно контролируют только одну или две каспазы в образце. Кроме того, в то время как синтетические пептидные субстраты, содержащие сайты расщепления каспазы, которые флуоресцируют при расщеплении, использовались для мониторинга активации каспазы в клеточных или тканевых лизатах⁶⁹, эти субстраты часто могут расщепляться более чем одной каспазой, что затрудняет определение специфической активации отдельных каспаз в этой системе. Кроме того, использование вестерн-блоттинга, а не флуоресцентных репортеров или других методов, основанных на метках, позволяет исследователям использовать эндогенные клетки, а не создавать специфические клеточные линии с репортерными генами. Использование эндогенных клеток имеет множество преимуществ, в том числе тот факт, что многие иммортализированные клеточные линии испытывают дефицит ключевых молекул клеточной смерти^72,73, что может повлиять на результаты. Кроме того, использование эндогенных клеток позволяет оценивать различные типы клеток, такие как макрофаги, эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки, а не одну линию. Западное блоттинг также является относительно простым и экономичным методом, который можно проводить в лабораториях по всему миру без необходимости использования большого, дорогостоящего оборудования или сложных установок.

Этот протокол широко применим в биологии для понимания как зависящих от гибели клеток, так и независимых от гибели клеток функций каспаз, включая их строительные роли и функции в других воспалительных сигнальных путях⁷⁴. Применение этого метода позволяет использовать единый подход к изучению путей врожденного иммунитета PCD и воспалительной передачи сигналов при заболеваниях и состояниях, и этот протокол может быть использован для выявления критических регуляторных процессов и механистических связей, которые будут информировать о разработке будущих терапевтических стратегий.