Препарат, характеристики, токсичность и оценка эффективности назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in vitro и in vivo

Являясь одной из наиболее важных инноваций в области общественного здравоохранения, вакцины играют ключевую роль в борьбе с глобальным бременем болезней человека¹. Например, в настоящее время тестируется более 120 вакцин-кандидатов от болезней COVID-19, некоторые из которых были одобрены во многих странах². В недавних сообщениях говорится, что противораковые вакцины эффективно улучшили прогресс клинического лечения рака, поскольку они направляют иммунную систему больных раком на распознавание антигенов как чужеродных для организма³. Кроме того, множественные Т-клеточные эпитопы, расположенные внутри или снаружи опухолевых клеток, могут быть использованы для разработки пептидных вакцин, которые показали преимущества в лечении метастатического рака из-за отсутствия значительной токсичности, связанной с лучевой терапией и химиотерапией ^4,5. С середины 1990-х годов доклинические и клинические испытания для лечения опухолей проводились в основном с использованием антигенных пептидных вакцин, но лишь немногие вакцины проявляют адекватный терапевтический эффект у онкологических больных⁶. Кроме того, противораковые вакцины с пептидными эпитопами имеют плохую иммуногенность и недостаточную эффективность доставки, что может быть связано с быстрой деградацией внеклеточных пептидов, которые быстро диффундируют от места введения, что приводит к недостаточному поглощению антигена иммунными клетками⁷. Поэтому необходимо преодолевать эти препятствия с помощью технологии доставки вакцин.

OVA 257-264, MHC класс I-связывающий эпитоп_257-264, экспрессируемый в виде слитого белка, является часто используемым модельным эпитопом⁸. Кроме того, OVA_257-264 имеет решающее значение для адаптивного иммунного ответа против опухолей, который зависит от ответа цитотоксического Т-лимфоцита (CTL). Он опосредован антиген-специфическими CD8⁺ Т-клетками в опухоли, которые индуцируются пептидом OVA_257-264 . Характеризуется недостаточным количеством гранзима В, который высвобождается цитотоксическими Т-клетками, что приводит к апоптозу клеток-мишеней⁸. Однако введение свободного пептида OVA_257-264 может вызывать небольшую активность CTL, поскольку поглощение этих антигенов происходит в неспецифических клетках, а не в антигенпрезентирующих клетках (APC). Дефицит соответствующей иммунной стимуляции приводит к активности CTL⁵. Следовательно, индукция эффективной активности CTL требует значительного прогресса.

Благодаря барьеру, обеспечиваемому эпителиальными клетками, и непрерывной секреции слизи вакцинные антигены быстро удаляются из слизистой оболочки носа ^9,10. Разработка эффективного вакцинного вектора, который может проходить через ткань слизистой оболочки, имеет решающее значение, поскольку антигенпрезентирующие клетки расположены под эпителием^{слизистой оболочки 9}. Интраназальное введение вакцин теоретически индуцирует иммунитет слизистой оболочки для борьбы с инфекцией слизистой оболочки¹¹. Кроме того, назальная доставка является эффективным и безопасным методом введения вакцин из-за ее удобства, предотвращения кишечного введения и улучшения комплаентности пациентов⁷. Таким образом, назальная доставка является хорошим средством введения новой пептидной эпитопной нановакцины.

Было разработано несколько синтетических биоматериалов для объединения эпитопов межклеточных и клеточных взаимодействий. Некоторые биологически активные белки, такие как Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), были введены как часть структуры гидрогеля для придания биологической активности¹². Этот пептид, вероятно, способствует прикреплению, миграции и росту^{клеток 13} и связывает интегрины α 3β1 и α_6β1 для взаимодействия с различными типами раковых клеток. IKVAV представляет собой пептид клеточной адгезии, полученный из белка базальной мембраны ламинина α_{цепи 1}, который первоначально использовался для моделирования нейронного микроокружения и вызывания дифференцировки нейронов¹⁴. Поэтому поиск эффективного средства доставки этой новой вакцины важен для борьбы с болезнью.

Недавно зарегистрированные эмульсионные системы, такие как W805EC и MF59, также были составлены для доставки в нос инактивированной вакцины против гриппа или рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и проиллюстрированы как запускающие как слизистый, так и системный иммунитет¹⁵. Наноэмульсии (НЭ) обладают такими преимуществами, как простота введения и удобное совместное образование с эффективными адъювантами по сравнению с системами доставки слизистой оболочки твердых частиц¹⁶. Сообщалось, что наноэмульсионные вакцины изменяют аллергический фенотип устойчивым образом, отличным от традиционной десенсибилизации, что приводит к долгосрочным подавляющим эффектам¹⁷. Другие сообщили, что наноэмульсии в сочетании с Mtb-специфическими иммунодоминантными антигенами могут индуцировать мощные реакции клеток слизистой оболочки и обеспечивать значительную защиту¹⁸. Поэтому была разработана новая интраназальная самоорганизующаяся нановакцина с синтетическим пептидом IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, пептид, состоящий из IKVAV, связанного с OVA_257-264). Важно систематически оценивать эту новую нановакцину.

Целью этого протокола является систематическая оценка физико-химических характеристик, токсичности и стабильности нановакцины, определение того, усиливается ли поглощение антигена, а также защитные и терапевтические эффекты с помощью технических средств, и уточнение основного содержания эксперимента. В этом исследовании мы установили ряд протоколов для изучения физико-химических характеристик и стабильности, определения величины токсичности клеток I-OVA NE to BEAS-2B с помощью CCK-8 и наблюдения за антигенпрезентирующей способностью клеток BEAS-2B к вакцине с помощью конфокальной микроскопии, оценки профилей высвобождения этой новой нановакцины in vivo и in vitroи определить защитный и терапевтический эффект этой вакцины с помощью модели мыши с опухолью E.G7-OVA.