インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製、特性、毒性、および有効性評価
Summary
ここでは、インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製および評価のための詳細な方法を提示する。
Abstract
エピトープペプチドは、その安全性、高い特異性、および便利な製造のために、腫瘍ワクチンの分野で広く注目を集めています。特に、一部のMHC I制限エピトープは、腫瘍細胞を除去するための効果的な細胞傷害性Tリンパ球活性を誘導することができます。さらに、経鼻投与は、その利便性と患者のコンプライアンスの向上により、腫瘍ワクチンの効果的かつ安全な送達技術です。しかしながら、エピトープペプチドは、免疫原性が低く、送達効率に乏しいため、経鼻送達には不適当である。ナノエマルジョン(NE)は、抗原を負荷し、鼻粘膜表面に直接送達することができる熱力学的に安定したシステムである。Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)は、ヒト呼吸上皮細胞によって発現されるインテグリン結合ペプチドであるラミニンのコアペンタペプチドです。本研究では、合成ペプチドIKVAV-OVA257-264(I-OVA )を含む鼻腔内自己組織化エピトープペプチドNE腫瘍ワクチンを低エネルギー乳化法により調製した。IKVAVとOVA257-264 の組み合わせは、鼻粘膜上皮細胞による抗原取り込みを増強することができる。ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)、原子間力顕微鏡(AFM)、動的光散乱(DLS)による物理化学的特性を研究するためのプロトコルを確立します。ムチンタンパク質の存在下での安定性;BEAS-2B細胞およびC57BL/6マウスの鼻および肺組織の細胞生存率を調べることによる毒性;共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)による細胞取り込み; 生体内の小動物を画像化することによってプロファイルを放出する。E.G7担癌モデルを用いたワクチンの保護および治療効果。このプロトコルは、新しいT細胞エピトープペプチド粘膜ワクチンの将来の開発のための技術的および理論的な手がかりを提供すると期待しています。
Introduction
最も重要な公衆衛生上の革新の1つとして、ワクチンは人間の病気の世界的な負担と戦う上で重要な役割を果たします1。たとえば、現在、COVID-19疾患の120を超えるワクチン候補がテストされており、そのうちのいくつかは多くの国で承認されています2。最近の報告によると、がんワクチンは、がん患者の免疫系に抗原を体外異物として認識させるため、臨床がん治療の進歩を効果的に改善しました3。さらに、腫瘍細胞の内側または外側に位置する複数のT細胞エピトープを使用してペプチドワクチンを設計することができ、放射線療法および化学療法に関連する有意な毒性がないため、転移性癌の治療に利点が示されています4,5。1990年代半ば以降、主に抗原ペプチドワクチンを用いた腫瘍治療の前臨床試験や臨床試験が行われてきましたが、がん患者に対して十分な治療効果を示すワクチンは少ない6。さらに、ペプチドエピトープを用いたがんワクチンは、免疫原性が低く、送達効率が不十分であり、これは投与部位から急速に拡散する細胞外ペプチドの急速な分解が原因であり、免疫細胞による抗原の取り込みが不十分である可能性がある7。したがって、ワクチン送達技術でこれらの障害を克服する必要があります。
OVA 257-264は、融合タンパク質として発現されるMHCクラスI結合257-264エピトープの、頻繁に使用されるモデルエピトープ8である。さらに、OVA257-264は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答に依存する腫瘍に対する適応免疫応答に極めて重要である。これは、OVA257-264ペプチドによって誘導される腫瘍内の抗原特異的CD8+ T細胞によって媒介される。これは、細胞傷害性T細胞によって放出される不十分なグランザイムBによって特徴付けられ、標的細胞のアポトーシスをもたらす8。しかしながら、遊離OVA257-264ペプチド投与は、これらの抗原の取り込みが抗原提示細胞(APC)ではなく非特異的細胞で起こるため、CTL活性をほとんど誘導しない可能性がある。適切な免疫刺激の欠乏はCTL活性をもたらす5.したがって、効果的なCTL活性の誘導には、かなりの進歩が必要です。
上皮細胞によって提供される障壁と粘液の継続的な分泌により、ワクチン抗原は鼻粘液から急速に除去されます9,10。抗原提示細胞は粘膜上皮9の下にあるため、粘膜組織を通過できる効率的なワクチンベクターの開発は非常に重要です。ワクチンの鼻腔内注射は、理論的には粘膜免疫を誘導して粘膜感染症と戦う11.さらに、経鼻分娩は、その利便性、腸管投与の回避、および患者のコンプライアンスの向上により、ワクチンの効果的かつ安全な投与方法です7。したがって、経鼻送達は、ナノワクチンの新規ペプチドエピトープに対する良好な投与手段である。
細胞-組織のエピトープと細胞-細胞相互作用を組み合わせるために、いくつかの合成生体材料が考案されています。Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)などの特定の生理活性タンパク質は、生物活性を付与するためにヒドロゲルの構造の一部として導入されています12。このペプチドは、細胞の付着、遊走、および伸長に寄与する可能性が高く13 、インテグリンα3β1 およびα6β1 に結合して、異なる癌細胞型と相互作用する。IKVAVは、もともと神経微小環境をモデル化し、神経分化を引き起こすために使用されたラミニン基底膜タンパク質α1鎖 に由来する細胞接着ペプチドです14。したがって、この新しいワクチンの効率的な送達手段を見つけることは、疾病管理にとって重要です。
W805ECやMF59などの最近報告されたエマルジョン系も、不活化インフルエンザワクチンまたは組換えB型肝炎表面抗原の鼻腔送達のために配合されており、粘膜免疫と全身免疫の両方を引き起こすことが示されています15。ナノエマルジョン(NE)は、粒子状粘膜送達系と比較して、容易な投与および効果的なアジュバントとの便利な共形成の利点を有する16。ナノエマルジョンワクチンは、従来の脱感作とは異なる持続的な方法でアレルギー表現型を変化させることが報告されており、長期的な抑制効果をもたらします17。他の人は、Mtb特異的免疫優性抗原と組み合わせたナノエマルジョンが強力な粘膜細胞応答を誘導し、有意な保護を与える可能性があることを報告しました18。そこで、合成ペプチドIKVAV-OVA257-264(I-OVA 、OVA257-264に結合したIKVAVからなるペプチド)を用いた新規鼻腔内自己組織化ナノワクチンを設計した。この新しいナノワクチンを体系的に評価することが重要です。
このプロトコルの目的は、ナノワクチンの物理化学的特性、毒性、および安定性を体系的に評価し、技術的手段を使用して抗原の取り込みと防御および治療効果が増強されているかどうかを検出し、主要な実験内容を詳しく説明することです。この研究では、物理化学的特性と安定性を研究し、CCK-8によるBEAS-2B細胞に対するI-OVA NEの毒性の大きさを決定し、共焦点顕微鏡を使用してワクチンに対するBEAS-2B細胞の抗原提示能力を観察するための一連のプロトコルを確立し、この新しいナノワクチンの放出プロファイルをin vivo および in vitroで評価しました、およびE.G7-OVA担癌マウスモデルを用いてこのワクチンの保護および治療効果を検出する。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫細胞膜で機能化されたナノワクチンは、疾患標的治療において大きな利点があり、副作用は、独特の腫瘍向性、特定の標的の同定、長期循環、細胞間相互作用の増強、および低い全身毒性などの特性によって最小限に抑えられます。また、他の治療モジュールと簡単に統合して、がんを共同で治療することもできます16,20。望ましい属性は、測…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団プログラムの第31670938号、第32070924号、32000651、重慶の自然科学財団プロジェクトプログラムの第2014jcyjA0107号および第2019jcyjA-msxmx0159号、陸軍医科大学特別プロジェクトの第2020XBK24号および第2020XBK26号、および大学生向けの国家イノベーションおよび起業家精神プログラムの第202090031021号および第202090031035号によってサポートされました。
Materials
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
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