Выделение и количественная оценка вируса Эпштейна-Барра из клеточной линии P3HR1
Summary
Этот протокол позволяет выделять вирусные частицы Эпштейна-Барра из клеточной линии P3HR1 человека при индуцировании вирусного литического цикла форболом 12-миристатом 13-ацетатом. ДНК впоследствии извлекается из вирусного препарата и подвергается ПЦР в режиме реального времени для количественной оценки концентрации вирусных частиц.
Abstract
Вирус Эпштейна-Барра (EBV), официально обозначенный как вирус герпеса человека 4 (HHV-4), является первым изолированным опухолевым вирусом человека. Почти 90-95% взрослого населения мира инфицировано ВЭБ. С недавними достижениями в области молекулярной биологии и иммунологии применение экспериментальных моделей in vitro и in vivo обеспечило глубокое и значимое понимание патогенеза ВЭБ при многих заболеваниях, а также опухолегенеза, связанного с ВЭБ. Целью этого визуализированного экспериментального документа является предоставление обзора выделения вирусных частиц ВЭБ из клеток клеточной линии P3HR1 с последующей количественной оценкой вирусного препарата. Клетки P3HR1, первоначально выделенные из лимфомы Беркитта человека, могут продуцировать вирус P3HR1, который является штаммом ВЭБ типа 2. Литический цикл EBV может быть индуцирован в этих клетках P3HR1 путем обработки форболом 12-миристатом 13-ацетатом (PMA), давая вирусные частицы EBV.
Используя этот протокол для выделения частиц ВЭБ, клетки P3HR1 культивируют в течение 5 дней при 37 °C и 5% CO2 в полной среде RPMI-1640, содержащей 35 нг/мл PMA. Впоследствии питательную среду центрифугируют со скоростью 120 х г в течение 8 мин для гранулирования клеток. Затем вируссодержащий супернатант собирают и прядут вниз со скоростью 16 000 х г в течение 90 мин, чтобы гранулировать частицы ВЭБ. Затем вирусная гранула повторно суспендируется в полной среде RPMI-1640. За этим следует экстракция ДНК и количественная ПЦР в режиме реального времени для оценки концентрации частиц ВЭБ в препарате.
Introduction
Вирус Эпштейна-Барра (EBV) является первым опухолевым вирусом человека, который был выделен1. EBV, формально называемый вирусом герпеса человека 4 (HHV-4)2, является частью подсемейства вируса гамма-герпеса семейства вирусов герпеса и является прототипом рода Lymphocryptovirus . Почти 90-95% взрослого населения мира инфицировано вирусом3. В большинстве случаев первоначальная инфекция происходит в течение первых 3 лет жизни и протекает бессимптомно, однако, если инфекция происходит позже в подростковом возрасте, она может привести к заболеванию, называемому инфекционным мононуклеозом4. ВЭБ способен инфицировать покоящиеся В-клетки, побуждая их становиться пролиферативными В-лимфобластами, в которых вирус устанавливает и поддерживает латентно инфицированное состояние5. ВЭБ может реактивироваться в любое время и, таким образом, привести к рецидивирующим инфекциям6.
За последние 50 лет связь между некоторыми вирусами и развитием злокачественных новообразований человека становится все более очевидной, и сегодня, по оценкам, от 15% до 20% всех видов рака человека связаны с вирусными инфекциями7. Вирусы герпеса, включая ВЭБ, являются одними из наиболее изученных примеров этих типов опухолевых вирусов8. Фактически, ВЭБ может вызывать многие типы злокачественных новообразований человека, такие как лимфома Беркитта (BL), лимфома Ходжкина (HL), диффузная крупная В-клеточная лимфома и лимфопролиферативные заболевания у иммунокомпрометированных хозяев 9,10. Было также показано, что ВЭБ связан с развитием системных аутоиммунных заболеваний. Некоторыми примерами этих аутоиммунных расстройств являются ревматоидный артрит (РА), полимиозит-дерматомиозит (PM-DM), системная красная волчанка (SLE), смешанное заболевание соединительной ткани (MCTD) и синдром Шегрена (SS)11. ВЭБ также связан с развитием воспалительного заболевания кишечника (ВЗК)12.
Многие из этих заболеваний могут быть изучены или смоделированы с использованием клеточной культуры, мышей или других организмов, инфицированных ВЭБ. Вот почему частицы ВЭБ необходимы для заражения клеток или организмов, будь то in vitro или in vivo модели 13,14,15,16, отсюда необходимость разработки метода, который позволяет выделять вирусные частицы при низких затратах. Протокол, описанный здесь, предоставляет рекомендации по простому способу надежного выделения частиц ВЭБ из относительно доступной клеточной линии и количественного определения частиц с использованием ПЦР в режиме реального времени, которая является экономически эффективной и легко доступной для большинства лабораторий. Это по сравнению с несколькими другими методами, которые были описаны для выделения ВЭБ из различных клеточных линий 17,18,19,20.
P3HR-1 представляет собой клеточную линию BL, которая растет в суспензии и латентно инфицирована штаммом EBV типа 2. Эта клеточная линия является продуцентом ВЭБ и может быть индуцирована для производства вирусных частиц. Целью этой рукописи является демонстрация метода, который позволяет выделить частицы ВЭБ из клеточной линии P3HR-1 с последующей количественной оценкой вирусного запаса, который впоследствии может быть использован как для экспериментальных моделей ВЭБ in vitro , так и in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Производство частиц ВЭБ необходимо для понимания биологии этого вируса, а также связанных с ним заболеваний. Здесь мы описали производство этих частиц из клеточной линии P3HR-1. Эта клеточная линия не является единственной линией EBV-производителя; фактически, частицы ВЭБ также были выдел?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этой работы было поддержано грантами ER от Исследовательского фонда Асмара, Ливанского национального совета по научным исследованиям (L-CNRS) и Плана медицинской практики (MPP) в Американском университете Бейрута.
Materials
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
References
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
- Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
- Manet, E., Schwab, M. . Encyclopedia of Cancer. , 1602-1607 (2017).
- Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
- Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
- Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
- El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
- Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
- Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
- Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
- Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
- Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
- Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
- Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
- Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
- Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
- Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
- Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Recherche en cancérologie. 47 (16), 4407-4412 (1987).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
- Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
- Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
- Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
- Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
- Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
- Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).
