ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석
Summary
살모넬라 균 은 살모넬라 특이 적 액포와 세포질에서 자유 (과다 복제) 모두에서 장 상피 세포 내부를 침범하고 복제합니다. 고처리량 형광 현미경 기반 프로토콜은 ImageJ를 통한 두 가지 보완 이미지 분석을 통해 살모넬라균 의 세포 내 표현형을 정량화하여 단일 세포 분해능 및 스코어링에 도달하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.
Abstract
살모넬 라 균은 장 상피를 침범하고 살모넬라 균 특이 적 액포 내부와 세포질에서 자유 (세포질 과잉 복제) 모두에서 장 세포에서 복제 할 수있는 장 병원체입니다. 이러한 세포 내 복제의 이러한 다양한 표현형은 병인의 다른 경로, 즉 세포질 과복제는 염증성 세포 사멸 및 장 내강으로의 압출을 유도하는 반면, 액포 복제는 상피 횡단 침투 및 전신 확산을 유도합니다. mCherry와 GFP의 차별적 발현에 의해 액포와 세포질 박테리아를 구별할 수 있는 pCHAR-Duo 형광 리포터 플라스미드와 같은 침범된 세포 내에서 살모넬라 균의 거동을 연구하기 위한 현미경 도구를 만들기 위해 상당한 노력을 기울였습니다. 그러나 세포 내 표현형은 종종 수동으로 점수를 매기므로 분석을 소수의 샘플과 세포로 제한하는 시간 소모적 인 절차입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 무료로 제공되는 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 고처리량 프로토콜에서, 상피 세포는 96-웰 플레이트를 사용하여 pCHAR-Duo를 운반하는 살모넬라균 에 감염되었다. 이미징은 자동화된 형광 현미경을 사용하여 수행하였다. 그런 다음 두 가지 이미지 분석 방법을 적용하여 서로 다른 세부 수준에서 살모넬라균 의 세포 내 거동을 측정했습니다. 첫 번째 방법은 전체 세포 내 박테리아 부하와 세포질 과복제의 정도를 측정합니다. 빠르고 많은 수의 세포와 샘플의 스코어링이 가능하여 스크리닝 실험과 같은 고처리량 분석에 적합합니다. 두 번째 방법은 단일 세포 분석을 수행하여 감염된 세포의 비율, 살모 넬라균 의 평균 액포 부하 및 상피 세포 내부의 살모넬라균 행동에 대한 자세한 정보를 제공하는 세포질 과복제율을 결정합니다. 프로토콜은 살모넬라-장 세포 상호 작용의 주요 단계에 대한 배치 분석을 자동으로 실행하기 위해 특별히 설계된 ImageJ 스크립트로 수행 할 수 있습니다.
Introduction
살모넬라 균은 유럽 연합1에서 식 인성 질환의 발병을 일으키는 가장 빈번하게보고되는 박테리아 인자입니다. 살모넬라 감염의 주요 병리학 적 증상은 장염이며, 이는 섭취 후 장내 병원체 행동과 그에 따른 국소 염증 반응의 결과입니다2. 그러나 살모넬라 균은 또한 장 외 부위로 전파되어 특히 면역 저하 된 개인에게 전신 감염을 일으킬 수 있습니다. 살모넬라와 장 상피 사이의 상호 작용 유형은 감염의 결과를 결정합니다. 일단 장 내강에 들어가면 살모넬라 균은 장 상피 세포 내부로 침입하여 복제합니다. 세포 내 수준에서 살모넬라 균은 살모넬라 함유 액포 (SCV) 내에서 세포질 과복제와 액포 내 느린 복제의 두 가지 다른 복제 표현형을 나타낼 수 있습니다. 세포질 과복제는 염증성 숙주 세포 사멸 및 장 내강으로의 살모넬라 압출을 유도합니다3; 액포 복제는 상피 횡단 침투 및 전신 확산으로 이어집니다4. 따라서 침입 및 액포 대 세포질 복제의 정도가 감염 과정에 영향을 미칩니다.
살모넬라 균 속은 숙주 범위와 질병을 일으키는 능력이 다른 수천 개의 혈청 형을 포함하여 매우 다양합니다. 예를 들어 S입니다. Typhimurium은 관련없는 여러 숙주를 감염시키고 인간 살모넬라증의 주요 원인 중 하나를 나타 내기 때문에 일반 혈청으로 정의됩니다. 다르게, S. Derby는 대부분 돼지로부터 분리되기 때문에 돼지 적응 혈청 형으로 간주되지만 인간 감염을 담당하는 혈청 형의 상위 5 위에도보고됩니다1. 그러나 상피 세포 내부의 박테리아 행동에 대한 지식은 본질적으로 S와 같은 몇 가지 참조 균주에 대한 연구로 제한됩니다. Typhimurium SL1344, 이는 살모넬라 병원성의 광대 한 자연 다양성을 나타내지 않습니다. 살모넬라균의 다양한 균주와 상피 세포의 상호 작용을 특성화하는 것은 다양한 병원성을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이러한 이유로 많은 균주의 세포 내 거동을 빠르고 대부분 자동화된 방식으로 분석하기 위해 고처리량 형광 현미경 기반 프로토콜이 개발되었습니다. 이 프로토콜에서는 96웰 이미징 플레이트에서 상피 세포의 감염을 수행하고 자동 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득했습니다. pCHAR-Duo 플라스미드를 형광현미경을 통해 상피세포 내부의 살모넬라균의 침윤 및 복제 표현형을 관찰하기 위해 사용하였다5. 이 플라스미드는 모든 형질전환된 박테리아 세포에 의해 구성적으로 발현되는 적색 형광 리포터 mCherry를 코딩하는 유전자와 녹색 형광 리포터 GFP를 코딩하는 유전자를 운반하며, 그의 발현은 진핵 세포의 세포질에만 존재하고 SCV에는 없는 포도당-6-인산에 의해 활성화됩니다. 따라서 플라스미드는 mCherry 및 GFP 리포터의 차별적 발현에 의해 액포와 세포질 박테리아를 구별할 수 있습니다.
현미경 이미지의 액포 및 세포질 박테리아는 일반적으로 수동 스코어링6으로 정량화되지만 이는 분석을 소수의 샘플로 제한하는 시간 소모적인 방법입니다. 따라서 무료로 제공되는 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ7을 사용하여 영역 분석과 단일 셀 분석이라는 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 면적 분석은 획득 한 각 현미경 이미지에서 상피 세포, 적색 및 녹색 살모넬라 균이 차지하는 영역의 데이터를 사용하여 전체 세포 내 박테리아 부하와 세포질 과다 복제 정도를 측정합니다. 이 방법은 저배율에서 획득한 이미지에 적용할 수 있습니다. 따라서 적은 이미지로 많은 수의 상피 세포를 채점할 수 있어 획득 시간이 단축됩니다. 단일 세포 분석은 세포 분할을 사용하여 감염된 세포의 백분율, 평균 액포 부하 및 단일 세포 분해능으로 세포질 과복제를 받는 감염된 세포의 백분율을 결정합니다.
이 프로토콜에서는 이미지 분석의 모든 단계를 수동으로 수행하도록 자세히 설명하지만 특별히 설계된 ImageJ 스크립트로 동일한 분석을 자동화할 수 있습니다. 또한 이러한 스크립트를 사용하면 배치 분석을 실행하여 여러 이미지를 자동으로 분석하여 메서드 실행 속도를 높일 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
살모넬라 균이 장 상피 세포를 식민지화하는 방식은 감염 결과에 영향을 미칩니다. 침윤시, 세포질 과잉 복제는 장의 염증을 유도하는반면, 액포 복제는 전신 확산4을 유발할 수 있습니다. 살모넬라 균주는 장 상피 세포 내부를 침범하고 복제하는 능력이 다양 할 수 있습니다9. 실제로 살모넬라 균은 질병을 일으키는 능력이 다른 2,500 개 이상의 혈청 형으로 구성된 매우 다양한 속입니다. 또한 살모넬라 균은 유럽 연합에서 식 인성 발병의 가장 빈번하게보고되는 원인으로 인간 인구의 큰 확산을 나타냅니다1. 따라서 살모넬라균의 세포내 표현형을 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 고처리량 방법의 가용성은 많은 수의 살모넬라 균주 간의 병독성 차이를 평가하고 궁극적으로 이 병원균의 정확하고 균주 특이적 위험 평가를 허용하는 데 매우 중요합니다.
여기에 설명된 프로토콜은 상피 세포 내부의 살모넬라균 거동을 빠르고 자동화된 방식으로 측정합니다. 상피 세포의 감염은 96웰 이미징 마이크로플레이트에서 수행되며 이미지 획득에는 자동 형광 현미경이 사용되므로 이 프로토콜은 고처리량 애플리케이션에 적합합니다. 이 프로토콜은 pCHAR-Duo 플라스미드를 이용하며, 이는 2개의 형광 리포터5의 차등 발현을 통해 액포와 세포질 살모넬라균 을 구별할 수 있게한다. 살모넬라균 의 세포 내 표현형은 종종 수동 스코어링으로 분석되는데, 이는 균주당 많은 수의 균주 및 세포 배양을 분석하는 데 적합하지 않고 작업자의 오류 및 작업자 간 변동이 발생하기 쉬운 시간 소모적인 절차입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 영역 분석과 단일 세포 분석이라는 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 두 가지 분석을 개발했습니다. 프로토콜 실행을 가속화하기 위해 운영자 개입 없이 여러 수집 파일의 배치 분석을 위한 ImageJ 스크립트가 보조 파일로 제공됩니다.
면적 분석은 상피 세포의 핵이 특이적으로 차지하는 영역과 GFP와 함께 mCherry 또는 mCherry를 발현하는 살모넬라균 의 측정을 통해 상피 세포의 전체 집락화(감염 비율)와 과복제 수준(hyper-replication ratio)을 몇 단계로 정량화하도록 설계되었습니다. 영역 분석은 저배율에서 획득한 이미지에 적용되며, 액포와 과복제 살모넬라균 이 동일한 z-평면에 초점이 맞춰지고 현미경 필드당 많은 수의 상피 세포가 표시되어 획득 파일의 크기와 수가 줄어듭니다. 면적 분석을 통해 많은 수의 샘플에 대해 자동화되고 빠르며 계산적으로 가벼운 분석이 가능하므로 스크리닝 실험과 같은 고처리량 분석에 적합합니다.
단일 세포 분석은 세포 분할 및 세포 영역의 측정과 액포 및 세포질 과복제 살모넬라가 차지하는 면적의 백분율을 통해 얻은 단일 세포 분해능으로 상피 세포 내부의 살모넬라 표현형을 정량화하도록 설계되었습니다. 면적 분석을 통해 특징 지어지는 상피 세포의 전체 집락화는 감염된 세포의 백분율, 평균 액포 부하 및과 복제 속도의 세 가지 정량적 매개 변수로 분해되어 전체 식민지화에 대한 각 표현형의 기여도를 평가하고 정량화 할 수 있으므로 면적 분석 결과를 보완합니다. 단일 세포 분석이 제공하는 더 많은 세부 사항은 이미지 획득 및 분석 속도가 느려집니다. 실제로, 단일 셀 해상도를 달성하기 위해, 이미지 획득은 고배율에서 수행된다. 이는 초점이 맞춰진 액포 및 세포질 살모넬라균을 모두 관찰하기 위해 여러 z-평면이 필요하고 많은 수의 상피 세포를 채점하기 위해 샘플당 많은 수의 필드를 획득해야 하므로 면적 분석과 비교하여 획득 시간이 연장됨을 의미합니다. 또한 여러 개의 대용량 수집 파일을 분석하는 것은 계산적으로 까다롭기 때문에 적절한 워크스테이션이 필요합니다(6코어, 32GB RAM 워크스테이션 사용). 따라서 단일 세포 분석은 제한된 처리량 조건에서 독립형으로 사용하거나 상피 세포 내부의 살모넬라 표현형을 더 깊이 이해하기 위해 영역 분석에 결합된 두 번째 수준 방법으로 사용할 수 있습니다.
두 가지 보완 분석은 S를 사용하여 검증되었습니다. Tm, S. 더비 wt, 그리고 S. Derby ΔsipA는 상피 세포 내부의 그들의 행동이 침습 또는 복제 측면에서 이미 다른 것으로 알려져 있기 때문에 선택되었습니다 9,10. 영역 및 단세포 분석의 결과는 프로토콜이 시험된 균주의 특성에 따라 세포내 살모넬라 표현형의 차이를 정량적으로 구별할 수 있음을 보여준다. 더욱이, 이들 결과는 단일-세포 분석이 면적 분석을 사용하여 점수화된 전체 콜로니제이션에 대한 각각의 세포내 표현형(침윤, 액포 부하 및 세포질 복제)의 기여도의 정량화를 허용한다는 것을 입증한다.
이 프로토콜은 살모넬라균의 다양한 균주의 시험관 내 병원성을 연구하기 위해 여기에 적용되었지만 상피 세포 내부의 침입 및/또는 복제에 관여하는 유전자를 식별하기 위한 무작위 돌연변이 연구와 같은 다른 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. 또한, 상기 프로토콜은 INT407 세포 이외의 다른 세포주 내부의 살모넬라균의 거동을 분석하도록 조정될 수 있다. 또한 다른 세포 내 미생물의 세포 – 병원체 상호 작용을 연구하기위한 유사한 방법을 개발하기위한 출발점으로 사용될 수 있습니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 pCHAR-Duo 플라스미드를 공유해 주신 Olivia Steele-Mortimer 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 이탈리아 보건부의 자금 지원을 받아 PRC2019014 및 PRC2021004를 지원합니다.
Materials
| 96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
| Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
| Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
| Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
| Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
| Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
| Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
| HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
| Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
| Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
| Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
| Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
| Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
| Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
| Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
| Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |
References
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