Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET

Le transfert d’informations à travers la membrane plasmique dépend fortement de la fonction des récepteurs membranaires¹. La liaison du ligand à un récepteur entraîne un changement conformationnel et l’activation du récepteur. Ce processus est souvent de nature allostérique². Avec plus de 800 membres, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires chez l’homme3. En raison de leur rôle dans presque tous les processus cellulaires, les RCPG sont devenus des cibles importantes pour le développement thérapeutique. Dans le modèle canonique de signalisation GPCR, l’activation agoniste entraîne des changements conformationnels du récepteur qui activent ensuite le complexe protéique G hétérotrimérique via l’échange de GDP contre GTP à la poche de liaison nucléotidique de G_α. Les sous-unités G_α-GTP et G_βγ activées contrôlent alors l’activité des protéines effectrices en aval et propagent la cascade de signalisation ^4,5. Ce processus de signalisation dépend essentiellement de la capacité des ligands à modifier la forme tridimensionnelle du récepteur. Une compréhension mécaniste de la façon dont les ligands y parviennent est essentielle pour développer de nouvelles thérapies et concevoir des récepteurs et des capteurs synthétiques.

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) font partie de la famille des RCPG de classe C et sont importants pour les effets neuromodulateurs lents du glutamate et le réglage de l’excitabilité neuronale ^6,7. Parmi tous les RCPG, les RCPG de classe C sont structurellement uniques en ce sens qu’ils fonctionnent comme des dimères obligatoires. Les mGluR contiennent trois domaines structuraux : le domaine du piège à mouches de Vénus (VFT), le domaine riche en cystéine (CRD) et le domaine transmembranaire (TMD)⁸. Les changements conformationnels au cours du processus d’activation sont complexes et impliquent un couplage conformationnel local et global qui se propage sur une distance de 12 nm, ainsi que la coopérativité des dimères. Les conformations intermédiaires, l’ordre temporel des états et le taux de transition entre les états sont inconnus. En suivant la conformation des récepteurs individuels en temps réel, il est possible d’identifier les états intermédiaires transitoires et la séquence des changements conformationnels lors de l’activation. Ceci peut être réalisé en appliquant le transfert d’énergie de résonance de fluorescence^à molécule unique ^9,10 (smFRET), comme cela a été récemment appliqué pour visualiser la propagation des changements conformationnels lors de l’activation de mGluR2 ¹¹. Une étape clé dans les expériences FRET est la génération de capteurs FRET par insertion spécifique au site des fluorophores donneurs et accepteurs dans la protéine d’intérêt. Une stratégie d’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) a été adoptée^12,13,14,15 pour surmonter les limites des technologies typiques de marquage fluorescent spécifiques au site qui nécessitent la création de mutants sans cystéine ou l’insertion d’une grande étiquette génétiquement codée. Cela a permis d’observer le réarrangement conformationnel de l’essentiel liant allostérique, qui a rejoint les domaines de liaison et de signalisation du ligand de mGluR2. Dans ce protocole, un guide étape par étape pour effectuer des expériences smFRET sur mGluR2 est présenté, y compris l’approche pour le marquage spécifique au site de mGluR2 avec UAA pour fixer des fluorophores en utilisant la réaction de cyclisation de l’azoture catalysée par le cuivre. De plus, ce protocole décrit la méthodologie pour la capture directe des protéines membranaires et l’analyse des données. Le protocole décrit ici est également applicable à l’étude de la dynamique conformationnelle d’autres protéines membranaires.