Valutazione della transcitosi intestinale degli isolati neonatali di batteriemia di Escherichia coli

L’Escherichia coli è la causa più comune di sepsi ad esordio precoce nei neonati ^1,2,3. Il tasso di mortalità della batteriemia neonatale di E. coli può raggiungere il 40% e la meningite è una possibile complicanza associata a gravi disabilità dello sviluppo neurologico². L’ingestione di ceppi materni di E. coli da parte del neonato può produrre batteriemia neonatale; Questo processo è stato replicato in modelli animali ^2,4. Una volta ingeriti, i batteri patogeni viaggiano dal lume intestinale neonatale attraverso la barriera intestinale ed entrano nel flusso sanguigno, causando setticemia. I ceppi neonatali invasivi di E. coli che producono batteriemia variano nella loro capacità di invadere le cellule epiteliali intestinali ^1,5. Tuttavia, la loro capacità di transcitare l’epitelio intestinale dopo l’invasione non è stata completamente caratterizzata.

Questo modello di transcitosi intestinale è un utile metodo in vitro per emulare il passaggio batterico attraverso l’epitelio intestinale. L’obiettivo generale dei metodi presentati in questo manoscritto è quello di confrontare la capacità degli isolati neonatali di E. coli di transcitare l’epitelio intestinale. Il modello qui descritto utilizza cellule T84, che sono cellule di adenocarcinoma intestinale umano immortalizzate ^6,7. Le cellule T84 vengono coltivate fino alla confluenza su una membrana semipermeabile con due compartimenti separati. Il razionale per l’utilizzo di questa tecnica è che, come accade in vivo, queste cellule intestinali si polarizzano e sviluppano giunzioni strette mature ^6,8. Il lato a contatto con la membrana diventa il lato basale. Il lato opposto delle cellule diventa il lato apicale, simile al lume intestinale dove i patogeni ingeriti aderiscono e invadono. La membrana transwell è permeabile ai batteri, ma le cellule intestinali polarizzate formano giunzioni strette, che compromettono il movimento paracellulare batterico⁹. Pertanto, questo metodo offre il vantaggio di un ambiente controllato in vitro che utilizza una linea cellulare umana per studiare il processo di transcitosi batterica, compresa la via transcellulare. Mentre esistono altri metodi per studiare la transcitosi dei batteri attraverso l’epitelio intestinale, il metodo transwell qui presentato offre maggiore facilità e accessibilità. Sono disponibili tecniche alternative, come quelle che utilizzano campioni ex vivo installati nei sistemi di camere di Ussing. Tuttavia, utilizzano campioni di tessuto che potrebbero non essere facilmente accessibili, in particolare se la ricerca intende studiare la fisiologia umana¹⁰. Gli organoidi intestinali rappresentano un altro esempio di alternativa in vitro per lo studio delle interazioni ospite-batteri¹¹. Mentre i monostrati organoidi possono anche essere utilizzati nel sistema transwell per studiare la transcitosi batterica, richiedono l’isolamento e la crescita delle cellule staminali e l’uso di specifici fattori di crescita per indurre la differenziazione¹². Pertanto, il loro uso è più dispendioso in termini di tempo e associato a costi maggiori rispetto al metodo transwell descritto in questo manoscritto.

La valutazione del passaggio batterico attraverso l’epitelio intestinale utilizzando questo sistema transwell in vitro è stata eseguita con successo per vari agenti patogeni. Questi studi hanno dimostrato l’utilità del sistema transwell utilizzando cellule T84 per caratterizzare la transcitosi dei batteri attraverso l’epitelio intestinale polarizzato^13,14,15. Tuttavia, l’applicazione di questo metodo transwell per confrontare la capacità di transcitosi dei ceppi neonatali di E. coli produttori di batteriemia non è stata descritta in dettaglio. Questo manoscritto fornisce ad altri ricercatori un protocollo transwell standard che è affidabile e facile da usare e non richiede risorse troppo costose.

Per confrontare la capacità dei ceppi neonatali invasivi di E. coli di transcitare l’epitelio intestinale, il lato apicale del monostrato epiteliale intestinale può essere infettato da un numero noto di cellule batteriche. Dopo l’incubazione, il mezzo sul lato basale dell’epitelio può essere raccolto e i batteri quantificati per determinare la quantità di transcitosi batterica nel tempo. In questo manoscritto, i metodi presentati sono utilizzati per studiare la capacità di transcitosi di ceppi clinici neonatali di E. coli recuperati da neonati ospedalizzati con batteriemia. I criteri di inclusione per la selezione di questi isolati clinici neonatali per gli studi di transcitosi sono stati pubblicati in precedenza ^1,2,16. Quando questo metodo viene eseguito utilizzando diversi ceppi di E. coli, le loro capacità di transcitosi possono essere confrontate. Attraverso questo processo, il modello di transcitosi intestinale fornisce dati preziosi per caratterizzare i fattori di virulenza di E. coli che contribuiscono al processo multifase che culmina nello sviluppo della batteriemia neonatale.