엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비
Summary
고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.
Abstract
포유류 심장의 발달을 뒷받침하는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 연구는 인간의 선천성 심장병을 해결하는 데 필수적입니다. 원시 심장 판막의 개발은 국소 유도 성 심근 및 심내막 신호에 반응하여 심장의 방실 관 (AVC) 및 유출로 (OFT) 영역에서 심내막 세포의 상피 – 중간 엽 전이 (EMT)를 포함합니다. 세포가 박리되어 심내막과 심근 사이에 위치한 세포 외 기질 (심장 젤리)을 침범하면 원시 심내막 쿠션 (EC)이 형성됩니다. 이 과정은 심내막이 박리 된 세포가 남긴 틈을 채워야하며 축을 따라 수렴 (좁게) 또는 확장 (길게)하기 위해 스스로를 재구성해야 함을 의미합니다. 현재의 연구는이 과정에 관여하는 요인의 세포 내 국소화를 조절하는 데 평면 세포 극성 (PCP) 경로를 연루시켰다. 고전적으로, 심장 판막 발달의 초기 단계는 배아 심장의 단면 또는 콜라겐 젤에서 배양 된 생체 외 AVC 또는 OFT 체 외 이식편에서 연구되었습니다. 이러한 접근법은 apico-basal 극성의 분석을 허용하지만 상피면 내의 세포 거동 또는 이동하는 세포의 형태 학적 변화에 대한 분석은 허용하지 않습니다. 여기에서는 판막 생성 영역에서 심내막을 세포의 평면 필드로 시각화 할 수있는 실험적 접근 방식을 보여줍니다. 이 실험적 접근법은 판막 개발 중에 OFT 및 AVC의 심내막 내에서 PCP, 평면 토폴로지 및 세포 간 통신을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 심장 판막 형태 형성과 관련된 새로운 세포 메커니즘을 해독하면 심내막 쿠션 결함과 관련된 선천성 심장 질환을 이해하는 데 기여할 수 있습니다.
Introduction
심장은 포유류 배아의 첫 번째 기능 기관입니다. 마우스에서 배아일(E) 7.5 전후, 양측 심장전 중배엽 세포는 복부 쪽에서 심장 초승달을 형성한다1. 심장 초승달에는 심근과 심내막2의 전구 세포를 포함하는 두 개의 심장 전 세포 집단이 있습니다. E8.0 주변에서 심장 전구체는 정중선에서 융합되어 두 개의 상피 조직인 외부 심근과 심장 젤리라는 세포외 기질로 분리된 특수 내피인 내부 심내막으로 구성된 원시 심장 튜브를 형성합니다. 나중에 E8.5에서 심장 튜브는 오른쪽으로 반복됩니다. 루프가 있는 심장은 유출로(OFT), 심실 및 심실관(AVC)과 같은 특정 분자 서명을 가진 다양한 해부학적 영역을 가지고 있습니다.3. 처음에는 심장 튜브가 세포4의 추가를 통해 유입 측에서 확장되지만, E9.5에서 집중적 인 심장 증식은 챔버의 팽창 및 섬유주 네트워크5의 확립을 초래한다. 판막 형성은 AVC (미래의 승모판 및 삼첨판 판막)와 OFT (미래의 대동맥 및 폐동맥 판막)에서 발생합니다.
심내막은 판막 발달에 중요한 역할을합니다. 심내막 세포는 AVC 및 OFT에서 상피-중간엽 전이(EMT)를 거쳐 판막 발달 초기에 나타나는 구조인 심내막 쿠션을 형성합니다. 다른 신호 경로가이 과정을 활성화합니다. 마우스의 E9.5에서 심근 유래 BMP2에 반응하여 심내막에서 활성화 된 NOTCH는 부착 접합 (AJ)의 막 횡단 구성 요소 인 혈관 내피 카드 헤린 (VE- 카드 헤린)의 발현을 직접 억제하는 TGFβ2 및 달팽이 (SNAI1)의 활성화를 통해 AVC 및 OFT 영역에서 심내막 세포의 침습성 EMT를 촉진합니다.6,7,8 . OFT에서, EMT를 개시하기 위한 심내막의 활성화는 FGF8 및 BMP4에 의해 매개되며, 그의 발현은 NOTCH 9,10,11,12에 의해 활성화된다.
EMT의 진행은 세포가 모양을 바꾸고, 이웃과의 접합부를 끊고 다시 만들고, 박리하고, 이동하기 시작함에 따라 세포 역학을 포함합니다13. 이러한 변화에는 AJ 리모델링 및 점진적 분해 14,15, 평면 세포 극성 (PCP) 신호 전달, apico-basal 극성 (ABP)의 손실, 정점 수축 및 세포 골격 조직 16,17이 포함됩니다. ABP는 세포의 전후축을 따라 단백질의 분포를 나타냅니다. 발달중인 심장에서 심근 세포의 ABP 조절은 심실 발달에 필요합니다18. PCP는 조직의 평면을 가로 질러 세포 내에서 단백질의 분극화 된 분포를 말하며 세포 분포를 조절합니다. 안정된 기하학적 구조를 가진 상피는 육각형 모양의 세포로 구성되며, 3 개의 세포 만 정점 19,20,21,22에서 수렴합니다. 상피 형태 형성 동안 발생하는 세포 분열, 이웃 교환 또는 박리와 같은 다양한 세포 과정은 꼭짓점에 수렴하는 세포의 수와 주어진 세포가 갖는 이웃 세포의 수를 증가시킵니다22. PCP와 관련된 이러한 세포 행동은 상이한 신호전달 경로, 액틴 역학, 또는 세포내 트래피킹에 의해 조절될 수 있다(23).
마우스에서 판막 발달을 연구하는 생성된 데이터는 E8.5 및 E9.5 배아 심장의 횡단, 관상 또는 시상 절편으로부터 얻어졌으며, 여기서 심내막은 세포의 장 대신에 세포의 선으로서 도시된다 – 심내막은 심장관(24)의 전체 내부 표면을 덮는다. 배아 절편은 마우스 배아의 심내막에서 PCP의 분석을 허용하지 않습니다. 우리의 새로운 실험 방법은 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이 심내막 세포 분포, AJ 이방성 및 단일 세포 모양 분석을 가능하게 합니다. 이러한 유형의 데이터는 이 보고서에 표시되지 않은 PCP와 관련된 다른 분자에 대한 설명과 함께 PCP 분석에 필요합니다. 전체 장착 면역 형광, 특정 샘플 준비 및 유전자 변형 마우스의 사용은 마우스의 판막 발달 시작시 심내막에서 평면 극성 분석을 가능하게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
심내막은 배아 심장 튜브의 전체 내부 표면을 덮는 상피 단층입니다. 판막 발달 동안 장래의 판막 부위의 심내막 세포는 EMT를 겪으므로 심내막 세포는 세포 골격을 변형시키고 재배열하여 심내막에서 심장 젤리쪽으로 박리됩니다. 우리와 다른 사람들은 심내막이 세포 6,8,24,32의 행으로 표시되는 E8.5 및 E9.5 배아 심장의 횡단 절편을 분석하여 마우스 배아의 판막 발달에 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 MCIN/AEI/10.13039/501100011033에서 J. L. P. J.G.-B에 대한 보조금 PID2019-104776RB-I00 및 CB16/11/00399(CIBER CV)의 지원을 받았습니다. 마드리드 코무니다드 (2020-5ª/BMD-19729)의 프로그램 데 아트라시온 데 탤런토가 자금을 지원했습니다. TG-C. Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054)가 자금을 지원했습니다. MCIN/AEI /10.13039/501100011033 및 FEDER “A way to make Europe”(#ICTS-2018-04-CNIC-16)이 공동 자금을 지원한 CNIC 단위의 현미경 및 동적 이미징, CNIC, ICTS-ReDib에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 사육에 대해 A. Galicia와 L. Méndez에게 감사드립니다. 이 출판물의 비용은 유럽 지역 개발 기금의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. CNIC는 ISCIII, MCIN 및 Pro CNIC 재단의 지원을 받으며 MCIN/AEI /10.13039/501100011033에서 자금을 지원하는 세베로 오초아 우수 센터(보조금 CEX2020-001041-S)입니다.
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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