Mikrofluidik-unterstützte selektive Depolarisation axonaler Mitochondrien
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aussaat und Färbung neuronaler Mitochondrien in mikrofluidischen Kammern. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern ermöglicht die selektive Behandlung von Mitochondrien in Axonen, um ihre Eigenschaften als Reaktion auf pharmakologische Herausforderungen zu analysieren, ohne das Zellkörperkompartiment zu beeinträchtigen.
Abstract
Mitochondrien sind die Hauptlieferanten von ATP (Adenosintriphosphat) in Neuronen. Mitochondriale Dysfunktion ist ein häufiger Phänotyp bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen. Angesichts der ausgeklügelten Architektur und extremen Länge einiger Axone ist es nicht verwunderlich, dass Mitochondrien in Axonen andere Umgebungen erfahren können als ihre Zellkörper-Gegenstücke. Interessanterweise geht die Dysfunktion der axonalen Mitochondrien oft Auswirkungen auf den Zellkörper voraus. Um axonale mitochondriale Dysfunktion in vitro zu modellieren, ermöglichen mikrofluidische Geräte die Behandlung von axonalen Mitochondrien, ohne die somalen Mitochondrien zu beeinflussen. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern verhindert die Diffusion von Molekülen gegen den Gradienten und ermöglicht so die Analyse der mitochondrialen Eigenschaften als Reaktion auf lokale pharmakologische Herausforderungen innerhalb von Axonen. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Aussaat von dissoziierten Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräten, die Färbung mit einem membranpotentialempfindlichen Farbstoff, die Behandlung mit einem mitochondrialen Toxin und die anschließende mikroskopische Analyse. Diese vielseitige Methode zur Untersuchung der axonalen Biologie kann auf viele pharmakologische Störungen und bildgebende Auslesungen angewendet werden und eignet sich für mehrere neuronale Subtypen.
Introduction
Mitochondrien sind die Hauptlieferanten von ATP (Adenosintriphosphat) in Neuronen. Da die neuronale Gesundheit eng mit der mitochondrialen Funktion verbunden ist, ist es nicht verwunderlich, dass eine dysfunktionale Regulation dieser Organellen mit dem Auftreten verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit1, in Verbindung gebracht wurde. Darüber hinaus wurde die mitochondriale Intoxikation erfolgreich eingesetzt, um Parkinson-Symptome bei Tieren zu modellieren2. Sowohl in Tiermodellen als auch bei menschlichen Krankheiten beginnt der Absterben von Neuronen an den distalen Teilen 3,4, was darauf hindeutet, dass axonale Mitochondrien anfälliger für Beleidigungen sein könnten. Die Biologie der Mitochondrien in Axonen ist jedoch aufgrund der Schwierigkeiten, die mit einer gezielten Behandlung und Analyse axonaler Mitochondrien bei gleichzeitiger Störung der Zellkörperprozesse verbunden sind, nicht gut verstanden.
Jüngste Fortschritte bei der Kultivierung von dissoziierten Neuronen in vitro ermöglichen nun die fluidische Trennung von Axonen und Zellkörpern durch mikrofluidische Geräte5. Wie in Abbildung 1A dargestellt, verfügen diese Geräte über vier Zugangsmulden (a/h und c/i), wobei zwei Kanäle jedes Paar (d und f) verbinden. Die großen Kanäle sind durch eine Reihe von 450 μm langen Mikrokanälen miteinander verbunden (e). Absichtliche Unterschiede in den Füllständen zwischen den beiden Kammern erzeugen einen Flüssigkeitsdruckgradienten (Abbildung 1B), der die Diffusion kleiner Moleküle aus dem Kanal mit einem niedrigeren Flüssigkeitsspiegel auf die andere Seite verhindert (Abbildung 1C, dargestellt mit Trypanblau-Farbstoff).
Wir haben kürzlich mikrofluidische Geräte verwendet, um lokale Translationsanforderungen in der axonalen Mitophagie, der selektiven Entfernung beschädigter Mitochondrien, zu untersuchen6. Im vorliegenden Protokoll werden verschiedene Schritte vorgestellt, um lokale mitochondriale Schäden durch selektive Behandlung von Axonen unter Verwendung des mitochondrialen Komplex-III-Inhibitors Antimycin A 6,7 zu induzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Aussaat und Kultur dissoziierter Hippocampus-Neuronen in einem mikrofluidischen Gerät, um axonale Mitochondrien separat zu behandeln. Der Nutzen dieses Ansatzes mit dem membransensitiven Farbstoff TMRE und dem Komplex-III-Inhibitor Antimycin A (wie zuvor gezeigt7) wird hier demonstriert, aber diese Methode kann leicht an andere mitochondriale Farbstoffe oder genetisch kodierte Sensoren mitochondrialer Funktionen angepasst werden, die lokale, m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (HA 7728/2-1 und EXC2145 Project ID 390857198) und der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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