Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

Il sistema nervoso centrale (SNC) dei mammiferi è altamente complesso, costituito da centinaia di diversi tipi di cellule, tra cui un vasto numero di diversi sottotipi neuronali 1,2,3,4,5,6. A differenza di altri organi o tessuti ^7,8,9, il SNC dei mammiferi ha una capacità rigenerativa molto limitata; la perdita neuronale a seguito di lesioni cerebrali traumatiche o neurodegenerazione è irreversibile e spesso si traduce in deficit motori e cognitivi¹⁰. Con l’obiettivo di salvare le funzioni cerebrali, diverse strategie per sostituire i neuroni persi sono oggetto di intense indagini¹¹. Tra questi, la riprogrammazione diretta delle cellule somatiche in neuroni funzionali sta emergendo come un approccio terapeutico promettente¹². La riprogrammazione diretta, o transdifferenziazione, è il processo di conversione di un tipo di cellula differenziata in una nuova identità senza passare attraverso uno stato proliferativo o pluripotente intermedio 13,14,15,16. Pioniere dell’identificazione di MyoD1 come fattore sufficiente per convertire i fibroblasti in cellule muscolari^17,18, questo metodo è stato applicato con successo per riprogrammare diversi tipi di cellule in neuroni funzionali 19,20,21.

Gli astrociti, la macroglia più abbondante nel SNC^22,23, sono un tipo di cellula particolarmente promettente per la riprogrammazione neuronale diretta per diversi motivi. In primo luogo, sono ampiamente e uniformemente distribuiti attraverso il SNC, fornendo un’abbondante fonte in loco per i nuovi neuroni. In secondo luogo, gli astrociti e i neuroni sono strettamente correlati allo sviluppo, in quanto condividono un antenato comune durante lo sviluppo embrionale, le cellule gliali radiali²⁴. L’origine embrionale comune dei due tipi di cellule sembra facilitare la conversione neuronale rispetto alla riprogrammazione di cellule provenienti da diversi strati germinali^19,21. Inoltre, le informazioni di pattern ereditate dagli astrociti attraverso la loro origine glia radiale sono mantenute anche negli astrociti adulti ^25,26,27 e sembrano contribuire alla generazione di sottotipi neuronali appropriati a livello regionale 28,29,30. Quindi, studiare e comprendere la conversione degli astrociti in neuroni è una parte importante del raggiungimento del pieno potenziale di questa tecnica per le strategie di sostituzione basate sulle cellule.

La conversione di astrociti in coltura in vitro in neuroni ha portato a diverse scoperte nel campo della riprogrammazione neuronale diretta, tra cui: i) l’identificazione di fattori di trascrizione sufficienti a generare neuroni dagli astrociti 15,19,31, ii) il dipanarsi di meccanismi molecolari innescati da diversi fattori di riprogrammazione nello stesso contesto cellulare ³² , e iii) evidenziando l’impatto dell’origine evolutiva degli astrociti sull’induzione di diversi sottotipi neuronali 28,29,33. Inoltre, la conversione diretta in vitro degli astrociti ha svelato diversi ostacoli importanti che limitano la riprogrammazione neuronale diretta^34,35, come l’aumento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS)³⁴ e le differenze tra il proteoma mitocondriale degli astrociti e i neuroni³⁵. Quindi, queste osservazioni supportano fortemente l’uso di colture primarie di astrociti come modello per la riprogrammazione neuronale diretta per indagare diverse questioni fondamentali in biologia¹², relative al mantenimento dell’identità cellulare, agli ostacoli che impediscono i cambiamenti del destino cellulare e al ruolo del metabolismo nella riprogrammazione.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per isolare astrociti da topi in età postnatale (P) con purezza molto elevata, come dimostrato isolando astrociti dal midollo spinale murino²⁹. Forniamo anche protocolli per riprogrammare gli astrociti in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del plasmide del DNA. Le cellule riprogrammate possono essere analizzate a 7 giorni dopo la trasduzione (7 DPT) per valutare vari aspetti, come l’efficienza di riprogrammazione e la morfologia neuronale, oppure possono essere mantenute in coltura per diverse settimane, per valutarne la maturazione nel tempo. È importante sottolineare che questo protocollo non è specifico per gli astrociti del midollo spinale e può essere prontamente applicato per isolare gli astrociti da varie altre regioni del cervello, tra cui la materia grigia corticale, il mesencefalo e il cervelletto.