Ensaios de transcrição in vitro podem decifrar os mecanismos de regulação transcricional em Borreliella burgdorferi. Este protocolo descreve as etapas para purificar a RNA polimerase de B. burgdorferi e realizar reações de transcrição in vitro. Abordagens experimentais usando ensaios de transcrição in vitro requerem purificação e armazenamento confiáveis da RNA polimerase ativa.
Borreliella burgdorferi é um patógeno bacteriano com repertórios metabólicos e genômicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados e carrapatos e remodela dramaticamente seu perfil transcricional para sobreviver em ambientes díspares durante a infecção. Um foco dos estudos de B. burgdorferi é entender claramente como a bactéria responde ao seu ambiente através de mudanças transcricionais. Ensaios de transcrição in vitro permitem dissecar bioquimicamente os mecanismos básicos de regulação transcricional. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo purificação e armazenamento da polimerase de RNA de B. burgdorferi , purificação do fator sigma, geração de molde de DNA e ensaios de transcrição in vitro . O protocolo descreve o uso da RNA polimerase purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC é uma cepa publicada anteriormente que abriga um 10XHis-tag no gene rpoC que codifica a maior subunidade da RNA polimerase. Os ensaios de transcrição in vitro consistem na RNA polimerase purificada da cepa 5A4-RpoC, uma versão recombinante do fator sigma housekeeping RpoD e um molde de DNA de fita dupla gerado por PCR. Enquanto as técnicas de purificação de proteínas e as abordagens para montagem de ensaios de transcrição in vitro são conceitualmente bem compreendidas e relativamente comuns, as considerações de manuseio para RNA polimerases frequentemente diferem de organismo para organismo. O protocolo aqui apresentado destina-se a estudos enzimáticos da RNA polimerase de B. burgdorferi. O método pode ser adaptado para testar o papel de fatores de transcrição, promotores e modificações pós-traducionais na atividade da RNA polimerase.
A doença de Lyme e a febre recidivante são causadas por patógenos espiroquetas dos gêneros Borrelia e Borreliella 1,2,3. A doença de Lyme é uma proeminente doença transmitida por vetores na América do Norte e, consequentemente, a Borreliella burgdorferi é um organismo modelo proeminente para estudar a biologia das espiroquetas 4,5. Investigações sobre os mecanismos de regulação transcricional de B. burgdorferi visam compreender melhor suas adaptações às mudanças no ambiente à medida que circula entre seu carrapato vetor e hospedeiros mamíferos 6,7. Alterações no pH, temperatura, osmolaridade, disponibilidade de nutrientes, ácidos graxos de cadeia curta, ácidos orgânicos e níveis de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono modulam a expressão de genes importantes para a sobrevivência de B. burgdorferi em seu artrópodes vetor e infectar animais 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. A ligação dessas respostas a estímulos com mecanismos regulatórios tem sido um aspecto importante na pesquisa com B. burgdorferi19.
Fatores de transcrição e fatores sigma controlam a transcrição de genes que realizam processos celulares. As espiroquetas de Lyme e febre recidivante abrigam um conjunto relativamente escasso de fatores de transcrição e fatores sigma alternativos. Apesar disso, existem complexas alterações transcricionais direcionando as respostas de B. burgdorferi ao ambiente20,21,22. Os mecanismos específicos que conduzem as mudanças transcricionais em B. burgdorferi em resposta a mudanças ambientais permanecem obscuros. Ensaios de transcrição in vitro são ferramentas poderosas para o emprego de uma abordagem bioquímica para testar a função e os mecanismos regulatórios dos fatores de transcrição e fatores sigma23,24,25,26.
Um sistema de ensaio de transcrição in vitro utilizando a RNA polimerase de B. burgdorferi foi recentemente estabelecido24. Como as bactérias frequentemente têm fisiologias celulares únicas, RNA polimerases de diferentes espécies e gêneros respondem diferentemente às condições de purificação enzimática, armazenamento enzimático e tampão de reação27. B. burgdorferi também está geneticamente distante das muitas espécies bacterianas nas quais RNA polimerases têm sidoestudadas20. Aspectos da preparação enzimática, tais como condições de lise, lavagem e tampão de eluição, tampão de armazenamento, tampão de reação de transcrição in vitro e o método de construção do ensaio podem alterar a atividade da RNA polimerase. Neste trabalho, fornecemos um protocolo para a purificação da RNA polimerase e do fator sigma RpoD, a produção de molde linear de DNA de fita dupla e a construção de ensaios de transcrição in vitro para facilitar a reprodutibilidade entre laboratórios que utilizam este sistema. Detalhamos um exemplo de reação para demonstrar a faixa linear para transcrição dependente de RpoD e discutimos limitações e alternativas para essa abordagem.
Ensaios de transcrição in vitro construídos usando o protocolo apresentado foram recentemente utilizados para estudar o papel de um fator de transcrição em B. burgdorferi e podem ser aplicados para construir experimentos semelhantes usando outros fatores de transcrição, fatores sigma e moléculas23. Uma vez que a RNA polimerase ativa de B. burgdorferi tenha sido obtida e sua atividade detectada, componentes e condições dentro dos ensaios de transcrição in …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Investimento Estratégico em Ciências da Saúde Faculty Development Grant da Creighton University. A cepa B. burgdorferi RpoC-His10X foi gentilmente cedida pelo Dr. D. Scott Samuels da Universidade de Montana. A cepa de E. coli que abriga o plasmídeo pMAL-C5X que codifica um alelo rpoD marcado com proteína ligadora de maltose foi gentilmente cedida pelo Dr. Frank Gherardini do Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.
0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |