المكونات الأساسية لبوريليلا (بوريليا) بورغدورفيري في مقايسات النسخ المختبري
Summary
يمكن لفحوصات النسخ في المختبر فك رموز آليات تنظيم النسخ في Borreliella burgdorferi. يصف هذا البروتوكول خطوات تنقية بوليميراز B. burgdorferi RNA وإجراء تفاعلات النسخ في المختبر. تتطلب الأساليب التجريبية التي تستخدم مقايسات النسخ في المختبر تنقية وتخزينا موثوقا به لبوليميراز الحمض النووي الريبي النشط.
Abstract
Borreliella burgdorferi هو أحد مسببات الأمراض البكتيرية ذات الذخيرة الأيضية والجينومية المحدودة. ينتقل B. burgdorferi خارج الخلية بين الفقاريات والقراد ويعيد تشكيل ملفه النسخي بشكل كبير للبقاء على قيد الحياة في بيئات متباينة أثناء العدوى. تركز دراسات B. burgdorferi على الفهم الواضح لكيفية استجابة البكتيريا لبيئتها من خلال التغييرات النسخية. تسمح مقايسات النسخ في المختبر بتشريح الآليات الأساسية لتنظيم النسخ كيميائيا حيويا. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يصف تنقية وتخزين بوليميراز B. burgdorferi RNA ، وتنقية عامل سيغما ، وتوليد قالب الحمض النووي ، ومقايسات النسخ في المختبر . يصف البروتوكول استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي المنقى من B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC هي سلالة منشورة سابقا تحتوي على علامة 10XHis على جين rpoC الذي يشفر أكبر وحدة فرعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي. تتكون مقايسات النسخ في المختبر من بوليميراز الحمض النووي الريبي المنقى من السلالة 5A4-RpoC ، ونسخة مؤتلفة من عامل التدبير المنزلي سيجما RpoD ، وقالب الحمض النووي المزدوج الذي تم إنشاؤه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. في حين أن تقنيات تنقية البروتين ومناهج تجميع مقايسات النسخ في المختبر مفهومة جيدا من الناحية المفاهيمية وشائعة نسبيا ، فإن اعتبارات التعامل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي غالبا ما تختلف من كائن حي إلى آخر. تم تصميم البروتوكول المقدم هنا للدراسات الأنزيمية على بوليميراز B. burgdorferi RNA. يمكن تكييف الطريقة لاختبار دور عوامل النسخ والمروجين وتعديلات ما بعد الترجمة على نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي.
Introduction
يحدث مرض لايم والحمى الانتكاسية بسبب مسببات الأمراض اللولبية في أجناس Borrelia و Borreliella1،2،3. مرض لايم هو مرض بارز ينتقل عن طريق النواقل في أمريكا الشمالية ، وبالتالي ، فإن Borreliella burgdorferi هو كائن نموذجي بارز لدراسة بيولوجيا spirochete 4,5. تهدف التحقيقات في آليات B. burgdorferi لتنظيم النسخ إلى فهم أفضل لتكيفها مع التغيرات في البيئة أثناء دورانها بين ناقل القراد ومضيفات الثدييات 6,7. التغيرات في درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، والأسمولية، وتوافر المغذيات، والأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، والأحماض العضوية، والأكسجين المذاب ومستويات ثاني أكسيد الكربون تعدل التعبير عن الجينات التي تعتبر مهمة ل B. burgdorferi للبقاء على قيد الحياة في ناقل المفصليات وإصابة الحيوانات8،9،10،11،12،13،14،15 ،16,17,18. كان ربط هذه الاستجابات للمنبهات بالآليات التنظيمية جانبا مهما من أبحاث B. burgdorferi 19.
تتحكم عوامل النسخ وعوامل سيغما في نسخ الجينات التي تنفذ العمليات الخلوية. يحتوي لايم واللولبيات الحموية الانتكاسية على مجموعة متفرقة نسبيا من عوامل النسخ وعوامل سيغما البديلة. على الرغم من ذلك ، هناك تغييرات نسخية معقدة توجه استجابات B. burgdorferi للبيئة20،21،22. لا تزال الآليات المحددة التي تقود تغييرات النسخ في B. burgdorferi استجابة للتغيرات البيئية غير واضحة. مقايسات النسخ في المختبر هي أدوات قوية لاستخدام نهج كيميائي حيوي لفحص الوظيفة والآليات التنظيمية لعوامل النسخ وعوامل سيغما23،24،25،26.
تم مؤخرا إنشاء نظام فحص النسخ في المختبر باستخدام بوليميراز B. burgdorferi RNA24. نظرا لأن البكتيريا غالبا ما يكون لها فسيولوجيات خلوية فريدة ، فإن بوليميراز الحمض النووي الريبي من الأنواع والأجناس المختلفة يستجيب بشكل مختلف لتنقية الإنزيم وتخزين الإنزيم وظروف عازلة التفاعل27. B. burgdorferi هو أيضا بعيد وراثيا عن العديد من الأنواع البكتيرية التي تمت فيها دراسة بوليميراز الحمض النوويالريبي 20. يمكن لجوانب تحضير الإنزيم مثل ظروف التحلل والغسيل والشطف العازلة ، ومخزن التخزين المؤقت ، ومخزن تفاعل النسخ في المختبر ، وطريقة بناء الفحص أن تغير جميعها نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي. هنا ، نقدم بروتوكولا لتنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي وعامل سيجما RpoD ، وإنتاج قالب الحمض النووي الخطي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، وبناء مقايسات النسخ في المختبر لتسهيل التكاثر بين المختبرات التي تستخدم هذا النظام. نقوم بتفصيل مثال رد فعل لتوضيح النطاق الخطي للنسخ المعتمد على RpoD ومناقشة القيود والبدائل لهذا النهج.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام فحوصات النسخ في المختبر التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول المقدم مؤخرا لدراسة دور عامل النسخ في B. burgdorferi ويمكن تطبيقها لبناء تجارب مماثلة باستخدام عوامل النسخ الأخرى وعوامل سيغما والجزيئات23. بمجرد الحصول على بوليميراز الحمض النووي الريبي النشط من B. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل منحة تطوير أعضاء هيئة التدريس لصندوق الاستثمار الاستراتيجي للعلوم الصحية بجامعة كريتون. تم توفير سلالة B. burgdorferi RpoC-His10X من قبل الدكتور د. سكوت صامويلز من جامعة مونتانا. تم توفير سلالة الإشريكية القولونية التي تؤوي بلازميد pMAL-C5X الذي يشفر أليل rpoD المرتبط بالبروتين المرتبط بالمالتوز من قبل الدكتور فرانك غيرارديني من مختبرات روكي ماونتن ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
References
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
