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Biochimie

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/64074
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology,State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

Summary

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Abstract

Tradizionalmente, i citoscheletri di actina e microtubuli sono stati studiati come entità separate, limitate a specifiche regioni o processi cellulari e regolate da diverse suite di proteine leganti uniche per ciascun polimero. Molti studi ora dimostrano che le dinamiche di entrambi i polimeri citoscheletrici sono intrecciate e che questa diafonia è necessaria per la maggior parte dei comportamenti cellulari. Un certo numero di proteine coinvolte nelle interazioni actina-microtubulo sono già state identificate (ad esempio, Tau, MACF, GAS, formine e altro) e sono ben caratterizzate per quanto riguarda l’actina o i microtubuli da soli. Tuttavia, relativamente pochi studi hanno mostrato saggi di coordinazione actina-microtubulo con versioni dinamiche di entrambi i polimeri. Ciò può occludere i meccanismi di collegamento emergenti tra actina e microtubuli. Qui, una tecnica di ricostituzione in vitro basata sulla microscopia a riflessione interna totale (TIRF) consente la visualizzazione della dinamica dell’actina e dei microtubuli dall’unica reazione biochimica. Questa tecnica preserva la dinamica di polimerizzazione del filamento di actina o dei microtubuli singolarmente o in presenza dell’altro polimero. La proteina Tau disponibile in commercio viene utilizzata per dimostrare come i comportamenti dell’actina-microtubulo cambiano in presenza di una classica proteina reticolante citoscheletrica. Questo metodo può fornire informazioni funzionali e meccanicistiche affidabili su come le singole proteine regolatrici coordinano la dinamica actina-microtubulo a una risoluzione di singoli filamenti o complessi di ordine superiore.

Introduction

Storicamente, l’actina e i microtubuli sono stati visti come entità separate, ognuna con il proprio insieme di proteine regolatrici, comportamenti dinamici e posizioni cellulari distinte. Abbondanti prove dimostrano ora che i polimeri di actina e microtubuli si impegnano in meccanismi funzionali di crosstalk che sono essenziali per eseguire numerosi processi cellulari tra cui la migrazione, il posizionamento del fuso mitotico, il trasporto intracellulare e la morfologia cellulare 1,2,3,4. I diversi comportamenti coordinati che sono alla base di questi esempi dipendono da un intricato equilibrio di fattori di accoppiamento, segnali e proprietà fisiche. Tuttavia, i dettagli molecolari che sono alla base di questi meccanismi sono ancora in gran parte sconosciuti perché la maggior parte degli studi si concentra su un singolo polimero citoscheletrico in un momento 1,2,5.

L’actina e i microtubuli non interagiscono direttamente 6,7,8. La dinamica coordinata dell’actina e dei microtubuli osservata nelle cellule è mediata da fattori aggiuntivi. Sono state identificate molte proteine che si pensa regolino la diafonia actina-microtubule e le loro attività sono ben caratterizzate per quanto riguarda il solo polimero citoscheletrico 1,2. Prove crescenti suggeriscono che questo approccio a singolo polimero ha nascosto le doppie funzioni di alcune delle proteine / complessi che consentono gli eventi di accoppiamento actina-microtubulo 7,8,9,10,11,12,13. Gli esperimenti in cui sono presenti entrambi i polimeri sono rari e spesso definiscono meccanismi con un singolo polimero dinamico e una versione stabilizzata statica degli altri 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Pertanto, sono necessari metodi per studiare le proprietà emergenti delle proteine di coordinamento actina-microtubuli che possono essere pienamente comprese solo in sistemi sperimentali che impiegano entrambi i polimeri dinamici.

La combinazione di approcci di marcatura diretta delle proteine, tag di affinità geneticamente codificati e microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) è stata applicata con grande successo nei sistemi di ricostituzione biomimetica 19,20,21,22,23. Molti schemi bottom-up non contengono tutti i fattori che regolano le proteine nelle cellule. Tuttavia, la tecnologia “biochimica su un vetro di copertura” ha perfezionato molti meccanismi di dinamica dell’actina e dei microtubuli ad alte scale spaziali e temporali, compresi i componenti necessari per l’assemblaggio o lo smontaggio del polimero e il movimento delle proteine motorie 5,12,23,24,25,26,27 . Qui viene descritto un approccio a filamento singolo componente minimo per studiare l’accoppiamento actina-microtubulo in vitro. Questo protocollo può essere utilizzato con proteine purificate disponibili in commercio o altamente pure, proteine marcate fluorescenti, camere di perfusione ed esteso a schemi più complicati contenenti estratti cellulari o sistemi sintetici. Qui, la proteina Tau disponibile in commercio viene utilizzata per dimostrare come la dinamica citoscheletrica cambia in presenza di una proteina di accoppiamento actina-microtubulo, ma può essere sostituita da altri presunti fattori di coordinamento actina-microtubulo. Il principale vantaggio di questo sistema rispetto ad altri approcci è la capacità di monitorare contemporaneamente la dinamica di più polimeri citoscheletrici in un’unica reazione. Questo protocollo fornisce inoltre agli utenti esempi e semplici strumenti per quantificare le modifiche ai polimeri citoscheletrici. Pertanto, gli utenti del protocollo produrranno dati affidabili, quantitativi e di risoluzione a singolo filamento per descrivere i meccanismi che sono alla base del modo in cui le diverse proteine regolatrici coordinano la dinamica dell’actina-microtubulo.

Protocol

1. Lavare le coperture NOTA: Lavare (24 mm x 60 mm, #1.5) coverslips secondo Smith et al., 201328. Disporre le coperture in un contenitore di plastica per la posta a scorrimento. Immergere le coperture sequenzialmente nelle seguenti soluzioni e sonicare per 30-60 min, risciacquando con ddH2O 10 volte tra ogni soluzione: ddH2O con una goccia di sapone per i piatti; 0,1 M KOH. Conservare le coperture in etanolo al 100% per un massimo di 6 mesi.NOTA: non toccare le superfici di vetro con dita non amate. Usa invece la pinza. 2. Rivestimento pulito (24 mm x 60 mm, # 1,5) coverslips con mPEG- e biotina-PEG-silano NOTA: Questo protocollo utilizza specificamente un sistema biotina-streptavidina per posizionare actina e microtubuli all’interno del piano di imaging TIRF. Possono essere utilizzati altri rivestimenti e sistemi (ad esempio, anticorpi, poli-L-lisina, miosina NEM, ecc.). Aliquote di scongelamento delle polveri PEG-silano e biotina-PEG-silano. Sciogliere le polveri PEG in etanolo all’80% (pH 2,0) per generare soluzioni di rivestimento di 10 mg/mL mPEG-silano e 2-4 mg/mL biotina-PEG-silano, poco prima dell’uso.NOTA: le polveri PEG appaiono spesso disciolte ma potrebbero non essere a livello microscopico. La corretta risospensione richiede ~ 1-2 minuti con pipettaggio costante. Gli utenti sono incoraggiati a pipettare altre 10 volte dopo la comparsa della dissoluzione della polvere.ATTENZIONE: Indossare guanti per proteggere la pelle dall’HCl concentrato quando si produce etanolo all’80% (pH 2,0). Rimuovere il coperchio pulito (24 mm x 60 mm, #1.5) dallo stoccaggio dell’etanolo utilizzando una pinza. Asciugare con azoto gassoso e conservare in una capsula di Petri pulita. Coat coverslips con 100 μL di soluzione di rivestimento: una miscela di 2 mg/mL mPEG-silano (MW 2.000) e 0,04 mg/mL biotina-PEG-silano (MW 3.400) in etanolo all’80% (pH 2,0).NOTA: per il rivestimento sparso (consigliato) utilizzare 2 mg/mL mPEG-silano e 0,04 mg/mL biotina-PEG-silano. Per il rivestimento denso utilizzare 2 mg/mL mPEG-silano, 4 mg/mL biotina-PEG-silano. Incubare i coperchi a 70 °C per almeno 18 ore o fino all’uso.NOTA: le coperture rivestite si degradano se conservate a 70 °C per più di 2 settimane. 3. Assemblaggio di camere di flusso di imaging Tagliare 12 strisce di nastro biadesivo a doppio supporto per una lunghezza di 24 mm. Rimuovere un lato del supporto del nastro e fissare i pezzi di nastro adiacenti alle sei scanalature presenti su una camera di imaging pulita.NOTA: il nastro deve essere piatto per un corretto assemblaggio, altrimenti le camere di imaging perderanno. Rimuovere con attenzione il supporto del nastro per evitare urti. Si consiglia di far scorrere le camere nastrate su una superficie pulita per lisciare i contatti della camera del nastro. Rimuovere il secondo pezzo di supporto del nastro per esporre il lato appiccicoso del nastro lungo ogni scanalatura della camera. Posizionare il nastro della camera su una superficie pulita. Mescolare resina epossidica e soluzioni indurenti 1:1 (o secondo le istruzioni del produttore) in una piccola barca di pesatura. Utilizzare una punta P1000 per posizionare una goccia di resina epossidica mista tra le strisce di nastro all’estremità di ciascuna scanalatura della camera di imaging (freccia rossa; Figura 1A). Posizionare il nastro della camera / lato epossidico verso l’alto su una superficie pulita. Rimuovere un coperchio rivestito dall’incubatore a 70 °C. Risciacquare le superfici rivestite e non rivestite di coverslips con ddH2O sei volte, asciugare con gas azoto filtrato e quindi apporre sulla camera di imaging con il lato di rivestimento coverslip verso il nastro. Utilizzare una punta della pipetta P200 o P1000 per esercitare pressione sull’interfaccia nastro-vetro per garantire una buona tenuta tra il nastro e il coperchio.NOTA: con una tenuta adeguata, il nastro biadesivo diventa traslucido. Le camere di imaging prive di sufficienti contatti a camera a nastro perderanno. Incubare le camere assemblate a temperatura ambiente per almeno 5-10 minuti per consentire alla resina epossidica di sigillare completamente i pozzetti della camera prima dell’uso. Le camere di perfusione scadono entro 12-18 ore dall’assemblaggio.NOTA: A seconda del posizionamento del nastro e dello spessore del nastro biadesivo utilizzato, la camera assemblata avrà un volume finale di 20-50 μL. 4. Condizionamento delle camere di perfusione Utilizzare una pompa di perfusione (velocità impostata su 500 μL/min) per scambiare in sequenza soluzioni di condizionamento in camera di perfusione come segue: Flusso 50 μL dell’1% BSA per innescare la camera di imaging. Rimuovere il buffer in eccesso dal serbatoio del raccordo Luer lock. Flusso 50 μL di 0,005 mg/mL di streptavidina. Incubare per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il buffer in eccesso dal serbatoio. Flusso 50 μL dell’1% BSA per bloccare il legame non specifico. Incubare per 10-30 s. Rimuovere il buffer in eccesso dal serbatoio. Portata 50 μL di tampone TIRF caldo (37 °C) 1x (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glucosio, 0,25% (v/v) metilcellulosa (4.000 cp)).NOTA: non rimuovere il buffer in eccesso dal serbatoio. Ciò impedisce alla camera di asciugarsi, il che può introdurre bolle d’aria nel sistema. Opzionale: Flusso 50 μL di semi di microtubuli biotinilati stabilizzatial 29 % e 50% diluiti in 1 tampone TIRF.NOTA: la corretta diluizione deve essere determinata empiricamente e contenere la variabilità da lotto a lotto. I protocolli da27,29 sono raccomandati come punti di partenza. Una diluizione che produce 10-30 semi per campo visivo funziona bene con questa configurazione. 5. Preparazione del microscopio NOTA: Le reazioni biochimiche contenenti filamenti dinamici di actina e microtubuli vengono visualizzate/eseguite utilizzando un microscopio TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) invertito dotato di laser a stato solido da 120-150 mW, un obiettivo TIRF a immersione di olio 63x corretto alla temperatura e una telecamera EMCCD. Le proteine in questo esempio sono visualizzate alle seguenti lunghezze d’onda: 488 nm (microtubuli) e 647 nm (actina). Impostare il dispositivo di riscaldamento stage/obiettivo in modo che mantenga 35-37 °C almeno 30 minuti prima di visualizzare la prima reazione biochimica. Impostare i parametri di acquisizione delle immagini come segue: Impostare l’intervallo di acquisizione ogni 5 s per 15-20 min. Impostare le esposizioni laser 488 e 647 a 50-100 ms con una potenza del 5%-10%. Impostare l’angolo TIRF appropriato per il microscopio.NOTA: indipendentemente dalla configurazione del microscopio, il modo più semplice per impostare la potenza del laser, l’esposizione e l’angolo TIRF consiste nell’effettuare regolazioni sulle immagini di entrambi i polimeri da soli (vedere 5.2.2.1 e 5.2.2.2, di seguito). Gli utenti sono fortemente incoraggiati a utilizzare le impostazioni di potenza ed esposizione laser più basse che consentono comunque il rilevamento. Regolare la reazione di polimerizzazione (Figura 1C) per avviare l’assemblaggio del filamento di actina e acquisire immagini a 647 nm. Apportare le modifiche appropriate. Regolare la reazione di polimerizzazione in un secondo pozzo di perfusione condizionato per avviare l’assemblaggio dei microtubuli (Figura 1C) e visualizzare a 488 nm. Apportare le modifiche appropriate. 6. Preparazione di miscele di reazioni proteiche Preparare la soluzione madre di tubulina marcata fluorescentemente. Determinare la concentrazione di tubulina non etichettata fatta in casa tramite spettrofotometria ad Abs280, come segue: Spettrofotometro vuoto con 1xBRB80 privo di GTP. Calcola la concentrazione di tubulina usando il coefficiente di estinzione determinato di 115.000 M-1 cm-1 e la seguente formula: Risospeso commercialmente liofilizzato lisina marcato 488-tubulina a 10 μM (1 mg / mL; etichetta al 100%) con 20 μL di 1x BRB80 privo di GTP. Scongelare su ghiaccio un’aliquota di 7,2 μL di 100 μM di tubulinariciclata 29 non etichettata.NOTA: La tubulina riciclata è fondamentale per il successo dell’assemblaggio di microtubuli in vitro perché rimuove i dimeri incompetenti per la polimerizzazione formati in scorte proteiche congelate29,30. Combinare 3 μL di 10 μM 488-tubulina con l’aliquota di 7,2 μL di tubulina non etichettata da 100 μM, non più di 15 minuti prima dell’uso. Preparare la soluzione madre di actina marcata fluorescentemente. Per le proteine fatte in casa, determinare la concentrazione e l’etichetta percentuale di actina tramite spettrofotometria Abs290 e Abs650, come segue: Spettrofotometro vuoto con G-buffer. Calcola la concentrazione di actina non etichettata usando il coefficiente di estinzione determinato di 25.974 M-1 cm-1 e la seguente formula: Calcola la concentrazione di lisina etichettata Alexa-647-actina usando il coefficiente di estinzione dell’actina non etichettata, il fattore di correzione del fluoro di 0,03 e la seguente formula:[Alexa-647 actina], μM = (Abs290 – Calcola l’etichetta percentuale di Alexa-647-actina utilizzando il ε determinato per Alexa-647 di 239.000 M-1 cm-1, come segue:% etichetta di Alexa-647-actina = (Abs290 – ( Scongelare un’aliquota di 2 μL di 3 μM 100% marcata biotina-actina (etichettata su residui di lisina). Diluire 10 volte aggiungendo 18 μL di G-buffer. Combinare 3 μL di actina biotinilata diluita, volumi appropriati di actina non etichettata ed etichettata (sopra) in modo tale che la miscela finale sarà di 12,5 μM di actina totale con etichetta fluorescente al 10%-30%.NOTA: più del 30% di percentuale di monomeri fluorescenti di actina (finale) possono compromettere la risoluzione dell’immagine poiché i filamenti diventano difficili da distinguere dallo sfondo. Preparare le miscele di reazione (Figura 1C). Preparare la miscela di citoscheletri (Tubo A) combinando 2 μL della miscela di actina da 12,5 μM (6.2.3) con la miscela di tubulina (6.1.4), non più di 15 minuti prima dell’imaging. Conservare sul ghiaccio fino all’uso. Preparare la miscela di reazione proteica (Tubo B) combinando tutti gli altri componenti sperimentali e proteine, tra cui: 2x tampone TIRF, anti-candeggina, nucleotidi, tamponi e proteine accessorie. Un esempio è mostrato nella Figura 1C.NOTA: la diluizione finale si traduce in un tampone TIRF 1x che contiene ATP, GTP e forza ionica all’interno dell’intervallo fisiologico stimato. Incubare separatamente il tubo A e il tubo B a 37 °C per 30-60 s. Per avviare la reazione, mescolare e aggiungere il contenuto del tubo B al tubo A (sotto). 7. Dinamica dell’actina e dei microtubuli dell’immagine Condizione perfusione bene (Figura 1B; passo 4, sopra). Iniziare l’assemblaggio simultaneo di actina e microtubuli aggiungendo il contenuto del tubo B (miscela di reazione) al tubo A (miscela di citoscheletro) (Figura 1C). Flusso 50 μL di reazione contenente 1x tampone TIRF integrato con 15 μM di tubulina libera, 1 mM GTP e 0,5 μM di monomeri di actina e volumi appropriati di controlli tampone. Registra filmati time-lapse utilizzando il software del microscopio per acquisire ogni 5 s per 15-20 minuti.NOTA: L’inizio della dinamica dell’actina e dei microtubuli avviene entro 2-5 minuti (Figura 2). Ritardi più lunghi indicano problemi con il controllo della temperatura o problemi legati alla concentrazione delle proteine nella miscela di reazione. Condizionare un nuovo pozzo di perfusione (fase 4) e sostituire il volume del tampone con proteine regolatorie di interesse (ad esempio, Tau) e controlli tampone (Figura 1C). Acquisire come descritto nella fase 7 (sopra) per valutare le proteine regolatrici per le funzioni emergenti di actina-microtubulo. 8. Elabora e analizza le immagini utilizzando il software FIJI31 Aprite i filmati TIRF salvati e visualizzateli come composito. Analizzare la dinamica dei microtubuli (Figura 3A), come segue: Generare una proiezione Z massima basata sul tempo dal menu delle pile di immagini. Sincronizza la finestra di proiezione Z con il filmato TIRF originale dal menu Analizza> Strumenti> Sincronizza Windows . Disegna una linea usando lo strumento linea retta lungo un microtubulo di interesse sull’immagine proiettata nel tempo. Aprire il gestore della regione di interesse (ROI) dal menu di analisi (Analizza> Strumenti> ROI Manager). Salvare le posizioni dei singoli microtubuli premendo “t”. Ripetere l’operazione per tutti i microtubuli di interesse. Traccia i kymograph delle linee selezionate usando “/” o esegui la macro multi-kymo che genera un video e un kymograph per ogni microtubulo nel ROI manager31. Aggiungete le barre di scala di lunghezza (μm) e di tempo (min) ai chimografi dal menu Strumenti di analisi>> Barre scala . Misurare le velocità di crescita dei microtubuli dalle pendenze del kymografo (Figura 3A, 1-2; pendenza delle linee nere). Contare gli eventi dinamici dei microtubuli (catastrofe o ricrescita) dal kymografo generato o utilizzando le macro di analisi disponibili 5,8,18,25. Le linee tratteggiate rosse nella Figura 3A, 1-2 rappresentano eventi catastrofici/di smontaggio rapido. Analizzare la dinamica dell’actina (Figura 3B), come segue: Misurare la nucleazione dell’actina, come segue: Contare il numero di filamenti di actina presenti nel campo visivo 100 s dopo l’inizio della reazione ed espressi dall’area (filamenti per μm2). Registra e salva i dati in ROI manager, come nel passaggio 8.2.3.1 di cui sopra. Misurare i tassi di allungamento del filamento di actina (Figura 3B), come segue: Disegna una linea lungo un filamento di actina di interesse usando lo strumento linea segmentata. Aggiungi la riga al ROI manager come nel passaggio 8.2.3.1, sopra. Ripeti seguendo la linea (aggiungendo ogni misurazione al ROI manager) per almeno quattro fotogrammi filmati.NOTA: si consiglia di misurare da sette a otto fotogrammi consecutivi, tuttavia alcune condizioni di polimerizzazione lenta dell’actina al di sotto del limite rilevabile che può essere risolto con configurazioni di obiettivi / microscopi. In tal caso, le misurazioni possono essere effettuate a intervalli regolari su fotogrammi non consecutivi (ad esempio, ogni cinque fotogrammi). Traccia i valori di lunghezza misurati sul tempo trascorso. La pendenza della linea generata è il tasso di allungamento dell’actina in micron/s. Trasmettere le velocità calcolate finali come subunità s-1 μM-1 utilizzando un fattore di correzione di 370 subunità per tenere conto del numero di monomeri di actina in un micron di filamento32. Eseguire analisi correlative per le regioni di associazione parallela actina-microtubulo (Figura 3C), come segue: Disegna una linea lungo un microtubulo di interesse in un punto temporale specifico (cioè 300 s dopo l’inizio della reazione), usando lo strumento della linea retta. Aggiungi la riga al ROI manager come nel passaggio 8.2.3.1, sopra. Traccia l’intensità della fluorescenza lungo la linea in ciascun canale. Seleziona ogni canale con il cursore dell’immagine e traccia le intensità lungo la linea usando il “comando k”. Salva o esporta i valori facendo clic sul pulsante “elenco” nella finestra di output. Esprimere gli eventi di accoppiamento actina-microtubulo come rapporto (actina sovrapposta a microtubuli) da singoli eventi o come conteggio di eventi in un dato campo visivo in un punto temporale coerente (Figura 3C). Alternativa: utilizzare il software per determinare la sovrapposizione percentuale di entrambi i canali 5,12.

Representative Results

Con le condizioni sopra descritte (Figura 1), i polimeri di actina e microtubuli dovrebbero essere visibili (e dinamici) entro 2 minuti dall’acquisizione dell’immagine (Figura 2). Come con qualsiasi protocollo basato sulla biochimica, l’ottimizzazione può essere necessaria per diverse proteine regolatorie o lotti di proteine. Per questi motivi, l’angolo TIRF e le esposizioni dell’immagine vengono impostati per primi con reazioni contenenti ogni singolo polimero. Ciò conferma che le proteine immagazzinate sono funzionali e che è presente una quantità sufficiente di proteine etichettate per il rilevamento. Anche se non sempre necessario (e non eseguito qui), la post-elaborazione dei filmati (ad esempio, sottrazione di sfondo, media o trasformazioni di Fourier) può essere utilizzata per migliorare il contrasto dell’immagine (in particolare dei microtubuli)5,25,33. La visualizzazione diretta di singoli filamenti di actina e microtubuli offerta da questo test supporta la determinazione quantitativa di diverse misure dinamiche per il componente del citoscheletro da solo o insieme, compresi i parametri di polimerizzazione (ad esempio, nucleazione o tasso di allungamento), i parametri di disassemblaggio (ad esempio, tassi di restringimento o eventi catastrofici) e il coalignamento / sovrapposizione del polimero (Figura 3 ). Inoltre, queste misure possono essere utilizzate come punto di partenza per decifrare il legame o l’influenza di ligandi regolatori come Tau (Figura 3). Molte misurazioni di singoli filamenti di actina o microtubuli possono essere effettuate da un film TIRF. Tuttavia, a causa delle variazioni nel rivestimento del coverslip, nel pipettaggio e in altri fattori, misurazioni affidabili dovrebbero includere anche più reazioni / filmati di replica tecnica. Molti aspetti della dinamica dei microtubuli possono essere determinati da esempi di chimografi, tra cui il tasso di allungamento dei microtubuli, nonché la frequenza degli eventi catastrofici e di soccorso (Figura 3A). L’uso di chimografi per misurare la dinamica dell’actina in questo sistema non è così semplice perché i filamenti di actina sono più contorti dei microtubuli. Di conseguenza, i parametri della dinamica del filamento di actina vengono misurati a mano, il che richiede tempo e lavoro. I conteggi di nucleazione sono misurati come il numero di filamenti di actina presenti in un punto temporale coerente per tutte le condizioni. Questi conteggi variano ampiamente tra i campi di imaging TIRF, ma possono essere utilizzati con molte repliche o per integrare le osservazioni di altri saggi di polimerizzazione. La conta di nucleazione può essere utilizzata anche per i microtubuli se le condizioni di prova mancano di semi di microtubuli stabilizzati. I tassi di allungamento del filamento di actina sono misurati come la lunghezza del filamento nel tempo da almeno quattro fotogrammi di film. I valori di velocità sono trasmessi per actina micromolare con un fattore di correzione di 370 subunità per tenere conto del numero di monomeri di actina in un micron di filamento (Figura 3B)32. Le misurazioni per definire i comportamenti coordinati tra actina e microtubuli sono meno ben definite. Tuttavia, sono state applicate analisi correlative per misurare la coincidenza di entrambi i polimeri, comprese le scansioni di linea (Figura 3C) o il software di sovrapposizione 5,11,34. Disponibilità dei dati:Tutti i set di dati associati a questo lavoro sono stati depositati in Zenodo e sono disponibili con ragionevole richiesta a: 10.5281 / zenodo.6368327. Figura 1. Schemi sperimentali: dall’assemblaggio della camera di flusso all’acquisizione delle immagini. (A) Assemblaggio della camera di imaging. Dall’alto verso il basso: le camere di imaging IBIDI sono registrate lungo i pozzetti di perfusione (indicati con una freccia); il secondo strato (bianco) di supporto del nastro (lasciato acceso nell’immagine mostrata per orientare meglio gli utenti) viene rimosso e la resina epossidica viene applicata sul bordo della camera di perfusione (freccia). Nota: per orientare più facilmente gli utenti dove posizionare la resina epossidica, il supporto bianco è stato lasciato acceso in questa immagine. Il coperchio pulito e rivestito è fissato alla camera di imaging con il lato del rivestimento rivolto verso l’interno del pozzo di perfusione. (B) Diagramma di flusso che illustra i passaggi per il condizionamento delle camere di imaging per i collegamenti biotina-streptavidina. (C) Esempi di reazioni utilizzate per acquisire film TIRF di microtubuli dinamici e filamenti di actina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. Sequenze di immagini di filamenti di actina e microtubuli in crescita in assenza o presenza di Tau. Montaggio di immagini time-lapse da saggi TIRF contenenti 0,5 μM di actina (10% Alexa-647-actina e 0,09% biotina-actina marcati) e 15 μM di tubulina libera (4% hilyte-488 etichettata) in assenza (A) o presenza (B) di 250 nM Tau. Viene mostrato il tempo trascorso dall’inizio della reazione (miscelazione del tubo A e del tubo B). Barre di scala, 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Esempio di misure di microtubuli e dinamica del filamento di actina. (A) La proiezione temporale media del canale della tubulina visualizza in modo efficiente le lunghezze totali dei microtubuli per le scansioni di linea utilizzate per generare grafici del chimografo. Le linee tratteggiate nere corrispondono ai due esempi di microtubuli dinamici mostrati a destra. Le fasi di crescita (linee nere solide) e di smontaggio (linee rosa punteggiate; due denotate con frecce rosa) dei microtubuli sono mostrate su ciascun kymograph. Barra della scala temporale, 3 min. Lunghezza scala barra, 10 μm. Reaction contiene 0,5 μM di actina (10% 647-label) e 15 μM di tubulina libera (4% 488-HiLyte label). Viene mostrato solo il canale della tubulina. (B) Due esempi di montaggi di immagini time-lapse raffiguranti filamenti di singola actina che polimerizzano attivamente. I tassi di allungamento sono calcolati come la pendenza dei grafici della lunghezza dei filamenti di actina nel tempo per actina micromolare. Pertanto, un fattore di correzione di due deve essere applicato alle reazioni di actina da 0,5 μM per il confronto con i tassi tipicamente determinati alla concentrazione di actina di 1 μM. Esempi di cinque filamenti sono mostrati a destra. Barre di scala, 10 μm. Reaction contiene 0,5 μM di actina (10% 647-label) e 15 μM di tubulina libera (4% 488-HiLyte label). Viene mostrato solo il canale actina. (C) Immagini TIRF di microtubuli dinamici (MT) (verde) e filamenti di actina (viola) polimerizzanti in assenza (a sinistra) o presenza di 250 nM Tau (al centro). Le linee tratteggiate e le frecce blu segnano dove è stata disegnata una linea per i grafici di scansione delle linee corrispondenti a ciascuna condizione (sotto ogni immagine). La sovrapposizione tra microtubuli e regioni di actina (mostrate come nere) può essere segnata in un determinato punto temporale per area (a destra). Barre di scala, 25 μm. Le reazioni contengono 0,5 μM di actina (10% 647-label) e 15 μM di tubulina libera (4% 488-HiLyte label) con o senza 250 nM Tau. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L’uso della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare le proteine purificate è stato un approccio fruttuoso e convincente per sezionare meccanismi unici di regolazione citoscheletrica 5,23,24,25,26,27,35. Rispetto ai saggi biochimici tradizionali, le reazioni TIRF richiedono volumi molto piccoli (50-100 μL) e le misurazioni quantitative della dinamica citoscheletrica possono essere raccolte da un singolo test. La maggior parte degli studi di dinamica citoscheletrica si concentrano su un singolo sistema polimerico (cioè filamenti di actina o microtubuli), quindi le misurazioni dettagliate della diafonia o dei comportamenti emergenti tra filamenti di actina e microtubuli tipicamente osservati nelle cellule sono rimaste sfuggenti e difficili da ricapitolare nella provetta. Per risolvere questo problema, questo protocollo descrive un sistema di microscopia TIRF a filamento singolo che consente la visualizzazione diretta di polimeri dinamici di actina e microtubuli nella stessa reazione biochimica. Pertanto, questo metodo va oltre i saggi tradizionali che ricapitolano il comportamento dinamico dei filamenti di actina o dei microtubuli da soli. Questa tecnica è stata eseguita anche con Tau come esempio di come diverse proprietà dinamiche cambiano in presenza di un fattore di accoppiamento citoscheletrico. Questo protocollo può essere utilizzato con proteine aggiuntive note o sospettate di coordinare la dinamica dell’actina o dei microtubuli, tra cui (ma non solo) MACF, GAS, formine e altro ancora. Infine, le analisi di esempio fornite possono essere utilizzate come guida per quantificare i dati acquisiti con questo protocollo.

“Vedere per credere” è una ragione convincente per eseguire saggi basati sulla microscopia. Tuttavia, è necessaria cautela nell’esecuzione e nell’interpretazione degli esperimenti di microscopia TIRF. Una delle principali sfide dei saggi di co-assemblaggio citoscheletrico è che molte condizioni di imaging comunemente usate non sono compatibili con ciascun polimero. I microtubuli e l’actina hanno tipicamente diversi requisiti di tampone, temperatura, sale, nucleotide e concentrazione per la polimerizzazione. L’actina, la tubulina, le proteine regolatrici di interesse e i tamponi utilizzati in questo protocollo sono sensibili ai cicli di congelamento-disgelo. Pertanto, è necessaria un’attenta gestione di proteine e tamponi per eseguire con successo questo protocollo. Per alleviare molte di queste preoccupazioni, si raccomanda vivamente l’uso di tubulina appena riciclata (congelata per <6 settimane) e la pre-compensazione delle actine congelate / risospenate tramite ultracentrifugazione. Queste considerazioni valgono anche per la miriade di proteine regolatrici da valutare con questa procedura, che possono essere sensibili ai cicli di congelamento-disgelo o alla concentrazione di sali tampone 5,11,36.

Sfortunatamente, non esiste un buffer valido per tutti senza compromessi sperimentali. Per appropriarsi di un volume maggiore per proteine a concentrazione inferiore, ATP e GTP possono essere inclusi nella soluzione tampone 2x TIRF (Figura 1C). Tuttavia, poiché questi nucleotidi sono estremamente sensibili ai cicli di congelamento-disgelo, non è raccomandato. I composti di scavenging dell’ossigeno utilizzati qui (cioè catalasi e glucosio-ossidasi) sono necessari per visualizzare le proteine per lunghi periodi di tempo (da minuti a ore), ma sono noti per limitare la polimerizzazione dei microtubuli ad alte concentrazioni5. In relazione a queste considerazioni sul tampone, una limitazione di questo protocollo è che alcune proteine regolatorie canoniche associate ai microtubuli possono richiedere più o meno sale per ricapitolare le funzioni presenti nelle cellule o nei saggi che utilizzano solo microtubuli (senza actina). Cambiare la natura o la concentrazione di sale per affrontare queste preoccupazioni probabilmente influenzerà i tassi di polimerizzazione del filamento di actina e / o i parametri della dinamica dei microtubuli. Le misurazioni di più parametri descrittivi (minimamente, nucleazione, tassi di allungamento e stabilità) (Figura 3) sono necessarie per confermare il successo del protocollo o per documentare esplicitamente gli effetti di specifici tamponi o proteine regolatrici. Ad esempio, una polimerizzazione eccessiva del filamento di actina può oscurare gli eventi di accoppiamento actina-microtubulo in pochi secondi. Di conseguenza, la messa a punto delle condizioni sperimentali abbassando la concentrazione complessiva di actina o includendo proteine aggiuntive per sopprimere la nucleazione dell’actina (cioè la profilina) estenderà il periodo complessivo in cui le attività coordinate di actina-microtubulo possono essere visualizzate chiaramente. I controlli che soddisfano questi prerequisiti e le repliche tecniche (al di là di più campi visivi) sono fondamentali per gli utenti per generare risultati affidabili e riproducibili.

Gli studi basati sulle cellule offrono un’opportunità limitata di osservare le relazioni dirette proteina-proteina o l’azione dei complessi regolatori. Al contrario, alcuni dei meccanismi raccolti dai saggi in vitro non sempre riflettono i comportamenti esatti delle proteine osservate nelle cellule. Questo classico dilemma biochimico può essere affrontato nelle future applicazioni di questa tecnica con modifiche specifiche. Ad esempio, l’aggiunta di proteine di accoppiamento funzionali marcate fluorescenti espande questo metodo dagli studi a singolo filamento agli studi a singola molecola. I saggi possono essere ulteriormente modificati per utilizzare estratti cellulari che possono aggiungere i fattori chiave sconosciuti “mancanti” necessari per ricapitolare fenomeni simili a cellule. Ad esempio, i saggi basati su TIRF che impiegano lievito o estratti di Xenopus hanno ricostituito gli anelli contrattili dell’actomiosina37, i fusi mitotici26,38, i componenti dell’assemblaggio di actina o microtubulo39,40 e persino la dinamica al centrosoma e ai cinetocori 36,41,42,43 . Inoltre, tali sistemi possono aprire la strada verso sistemi cellulari artificiali che hanno lipidi o fattori di segnalazionepresenti 44,45,46.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sono grato a Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) e Brian Haarer (SUNY Upstate) per i commenti utili su questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (GM133485).

Materials

1% BSA (w/v) Fisher Scientific BP1600-100 For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter.
1× BRB80 Homemade 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO G2133-50KU Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use
100 µM tubulin Cytoskeleton Inc, Denver, CO T240 Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
100 mM ATP Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO A-081 Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.
100 mM GTP Fisher Scientific AC226250010 Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.
120-150 mW solid-state lasers Leica Microsystems 11889151; 11889148
2 mg/mL catalase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO C40-100 Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use
2× TIRF buffer Homemade 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.
24 × 60 mm, #1.5 coverglass Fisher Scientific, Waltham, MA 22-266882 Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC water bath
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) Avantor, Philadelphia, PA RLS000-01 Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use
5 min Epoxy resin and hardener Loctite, Rocky Hill, CT 1365736 Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds Cytoskeleton Inc; Homemade T333P (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actin mix stock Homemade; this protocol A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).
Appropriate buffer controls Homemade Combination of buffers from all proteins being assessed
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) Laysan Bio Inc biotin-PEG-SIL-3400 Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Biotinylated actin Cytoskeleton Inc; Homemade AB07 Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.  Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.
Dishsoap Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.
Dry ice
FIJI Software www.https://imagej.net/software/fiji/downloads Schneider et al. (2012)31.
Fluorescently labeled actin Cytoskeleton Inc; Homemade AR05 Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use.
Fluorescently labeled tubulin Cytoskeleton Inc TL488M, TLA590M, TL670M Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
G-buffer Homemade 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Buffer Homemade 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Ice
Ice bucket
Imaging chambers IBIDI, Fitchburg, WI 80666 Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings
iXon Life 897 EMCCD camera Andor, Belfast, Northern Ireland 8114137
LASX Premium microscope software Leica Microsystems 11640611
Methylcellulose (4,000 cp) Sigma Aldrich Inc M0512
Microscope base equipped with TIRF module Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11889146
mPEG-silane (MW 2,000) Laysan Bio Inc, Arab, AL mPEG-SIL-2000 Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Objective heater and heated stage insert OKO labs, Pozzioli, Italy 8113569 Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.
Perfusion pump Harvard Apparatus, Holliston, MA 704504 A syringe and tubing can be substituted.
Petri Dish, 100 x 15 mm Genesee Scientific, San Diego, CA 32-107
Plastic slide mailer container Fisher Scientific HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick Grace Biolabs, Bend, OR 620001 Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.
Small styrofoam container Abcam, Cambridge, UK Reused from shipping
Small weigh boat Fisher Scientific 02-202-100
Spectrophotometer
Tau Cytoskeleton Inc TA01 Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20).
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective Leica Microsystems 11506319
Tubulin stock Homemade; this protocol A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.
Unlabeled actin (dark) Cytoskeleton Inc; Homemade AKL99 Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended).
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References

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Henty-Ridilla, J. L. Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e64074, doi:10.3791/64074 (2022).
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