Измерение Caenorhabditis elegans Чувствительность к агонисту рецепторов ацетилхолина Левамизол

1. Подготовка пластин для анализа левамизола Приготовьте среду для роста нематод (NGM), объединив 3 г NaCl, 2,5 г пептона и 17 г агара с 1 л деионизированной (DI) воды в колбе с перемешивающим батончиком. После автоклавирования поставьте носитель на конфорку, установленную на 70 °C, и перемешивайте с умеренной скоростью в течение 1 ч. Добавьте 1 мл 5 мг/мл холестерина по каплям, чтобы предотвратить осаждение, 1 мл 1M CaCl2, 1 мл 1 M MgSO4 и 25 мл 1 M pH 6,0 калийфосфатного буфера в среду. Переложите 2 мл среды NGM в каждую лунку 24-луночной пластины со стерильной серологической пипеткой (рисунок 1). Дайте тарелкам высохнуть на столешнице в течение 2 дней перед посевом бактериями. Для длительного хранения поместите их при температуре 4 °C. Вытрите OP50 E. coli на пластину лизогенного бульона (LB) и выращивайте в течение ночи при 37 °C. Выберите одну колонию OP50 в B-бульон (10 г триптона и 5 г NaCl в 1 л DI H2O) и нанесите культуру на 37 °C на ночь. Используя стерильную пипетку, капните 30 мкл суспензии OP50 на агар в середине каждой лунки (рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не повредили поверхность агара, так как это приведет к закапыванию червей. Дайте тарелкам постоять при комнатной температуре в течение не менее 2 дней после посева, чтобы сформировать бактериальный газон.ПРИМЕЧАНИЕ: Если бактерии в центре лунок не высохли через 2 дня, оставьте пластины открытыми в вытяжке на 20 мин (рисунок 1). Тарелки следует залить и засеять бактериями за 1-2 недели до анализа. 2. Синхронизация C. elegans (день 1) Выращивайте дикорастущих, unc-63(x26), lev-10(x17), и unc-49(e407) C. elegans до зрелого возраста на пластинах по 6 см, готовя не менее восьми пластин на сорт. Подтвердите, что на тарелках много неголодных взрослых особей.ПРИМЕЧАНИЕ: Это в два раза больше пластин, чем необходимо; однако важно иметь резервные пластины на случай, если первая партия яиц будет уничтожена во время отбеливания. Сделайте 10x M9 буфер, растворив 59,6 г Na2HPO4 (двухосновный), 29,9 г KH2PO4 (моноосновной), 12,8 г NaCl и 2,5 г MgSO4 в 750 мл воды DI с перемешиванием. После растворения доведите объем до 1 л и фильтруйте стерилизуем. Разбавьте 1:10 и автоклав, чтобы получить 1x буфер M9.ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер 1x M9 может быть сделан за недели или месяцы. Приготовьте отбеливающий раствор под капотом в день синхронизации. Смешайте 10 мл отбеливателя (таблица материалов), 2,5 мл 10 N NaOH и 37,5 мл воды DI в конической трубке объемом 50 мл. Носите очки, перчатки и лабораторное пальто при работе с отбеливающим раствором. Используя пластиковую передаточную пипетку, промойте гравидных взрослых червей по крайней мере с четырех пластин с буфером 1x M9 и переложите их в коническую трубку объемом 15 мл. Открутите при 716 х г в течение 1 мин при комнатной температуре, а затем удалите супернатант с помощью передаточной пипетки. Добавить 10 мл отбеливающего раствора. Переверните или осторожно встряхните трубку в течение ~4 мин, пока большинство, но не все, туши червя не растворятся (рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не отбелить червей, так как это уничтожит яйца. Некоторые мутации могут увеличить сложность изоляции яйцеклеток. Отжим при 716 х г в течение 1 мин. Вылить раствор отбеливателя одним движением; до тех пор, пока трубка не будет встряхнута в этой точке, яйца будут прилипать к боковой части трубки. Добавьте 15 мл 1x буфера M9 и инвертируйте. Вращайтесь при 716 x g в течение 1 мин и выливайте буфер M9 одним плавным движением. Выполните в общей сложности три промывки с 1 буфером M9, как описано в шаге 2.9. После окончательной промывки добавьте 10 мл свежего 1x M9 и поместите на ротатор на ночь при 15 °C, чтобы изолировать синхронизированную популяцию голодающих животных первой личиночной стадии (L1).ПРИМЕЧАНИЕ: Перед размещением на ротаторе проверьте, есть ли яйца в буфере M9. Если нет, повторите подготовку с резервными пластинами и отбеливателем в течение более короткого времени. 3. Покрытие синхронизировано C. elegans (день 2) Распечатайте карту плит с 24 скважинами и назначьте деформации рандомизированным местам. Каждая деформация должна быть представлена в 24-луночной плите не менее шести раз. Примерно через 24 ч после подготовки отбеливателя отшелушиваются вылупившиеся голодные черви L1 в буфере M9 при 716 х г в течение 1 мин при комнатной температуре. Удалите ~9 мл буфера M9 с помощью пластиковой передаточной пипетки, а затем осторожно перемешайте голодающих червей первой личиночной стадии (L1s) в оставшемся буфере M9. Немедленно пипетировать 3 мкл червей в буфере M9 на предметное стекло микроскопа и определить количество L1s; желаемое число составляет 20-30 L1s в 3 мкл. Открутите и удалите M9, если концентрация червя слишком низкая, и добавьте M9, если концентрация слишком высока.ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте количество червей на 3 мкл не менее 2x, каждый раз переворачивая трубку. Пипетка 3 мкл L1s (всего 20-30 червей) в каждую скважину в соответствии с предварительно составленной картой пластин (этап 3.1; Рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертируйте трубку с L1s в M9 часто, чтобы поддерживать равномерное распределение червей, поскольку они будут оседать на дно. Если этого не сделать, в некоторых колодцах будет слишком мало червей, в то время как в других будет слишком много. Кроме того, не прокалывайте агар наконечником пипетки, так как это заставит животных зарыться. Дайте червям вырасти до зрелого возраста в течение 3 дней при 20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование различных температур роста и определенных мутаций может повлиять на скорость созревания, поэтому обязательно учитывайте жизненный цикл C. elegans . 4. Выполнение анализа левамизола (день 5) Распечатайте пустое техническое описание, которое будет использоваться для записи количества червей, движущихся в каждой скважине каждые 5 минут в течение 1 часа.ПРИМЕЧАНИЕ: Студенты смогут подсчитывать червей не более чем в 12 скважинах каждые 5 минут. Верхние 12 скважин анализируются в первый час, а нижние 12 скважин анализируются в последующий час. Проверьте червей в 24-луночных пластинах. Используя маркер, сделайте «X» на крышке пластины над любыми скважинами, которые имеют загрязнение, голодают или имеют слишком много червей (>40), что затруднит подсчет. Внесите 0,4 мМ раствора левамизола, добавив 200 мкл 100 мМ запаса левамизола к 50 мл 1x M9. Приготовьте 100 мМ запаса левамизола, растворив 240,76 мг гидрохлорида левамизола в 10 млH2Oи храните его при температуре −20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Левамизол должен быть разбавлен в М9; разведение вH2Oускоряет паралич. Студенты должны носить перчатки. Прием внутрь высоких концентраций левамизола токсичен. Запустите таймер, а затем, используя передаточную пипетку, добавьте 1 мл 0,4 мМ левамизола в первые две скважины, чтобы животные свободно плавали. Продолжайте добавлять левамизол в соседние скважины, ошеломляя время в зависимости от количества скважин, подлежащих анализу.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если провести анализ 10 скважин, левамизол будет добавлен следующим образом: скважины 1 и 2 в момент 0, скважины 3 и 4 через 1 мин, скважины 5 и 6 через 2 мин, скважины 7 и 8 через 3 мин и скважины 9 и 10 через 4 мин. Через 5 минут начните вручную подсчитывать только количество движущихся червей в каждой скважине, начиная с первой скважины, и запишите это число в техническом описании (рисунок 1). Счетчики могут быть использованы, но не требуются для точного определения количества движущихся червей.ПРИМЕЧАНИЕ: Студенты должны следить за таймером, так как они иногда отстают в ранние моменты времени, прежде чем многие черви парализуются. Количество временных точек может быть скорректировано, или при необходимости может быть проанализировано меньше скважин в каждый момент времени. Продолжайте подсчитывать количество движущихся червей в каждой скважине каждые 5 мин в течение 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Погружение в M9 вызывает постоянное плавательное движение в течение этого 1-часового анализа, что устраняет необходимость подталкивания червей для оценки паралича (рисунок 2A). Воздействие 0,4 мМ раствора левамизола вызывает зависимый от времени паралич, наблюдаемый при прекращении плавания; черви, которые парализуют, не выздоравливают. Повторите шаги 4.4.-4.6. для остальных скважин в плите. В конце анализа или когда позволяет время, запишите общее количество червей в каждой скважине. 5. Анализ данных Получите карту пластин (шаг 3.1.) и запишите, какая деформация соответствует каждой скважине.ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за объема собранных данных последующий анализ и обсуждение данных займет не менее пары часов. Введите данные в электронную таблицу, начиная с общего количества червей в каждой скважине и организуя по генотипу. Объединив данные из скважин, определите количество червей, движущихся в каждой точке времени для каждой деформации. Используйте эти данные для создания «кривой выживания» в статистическом программном обеспечении (Таблица материалов) для визуального отображения зависящего от времени паралича популяции (рисунок 2B). Сделайте таблицу данных такой, чтобы в левом столбце указывалось время, а последующие столбцы содержали данные для каждого штамма. Для каждого животного, которое парализовано в течение первых 5 минут, создайте ряд и введите «1» в течение 5 минут. Повторите это для каждой точки времени. Для всех животных, которые не парализуются к концу анализа, введите «0» в течение 60 мин. Выполните парные сравнения, используя тест log-rank (Mantel-Cox) в статистическом программном обеспечении (Table of Materials), чтобы определить, существует ли статистически значимая разница между двумя различными штаммами. Для дополнительного/альтернативного анализа вместо выполнения шага 5.3. и шаг 5.4, определить процент животных, движущихся в каждой скважине в каждый момент времени. Постройте среднее значение со стандартной погрешностью в каждой точке времени для всех штаммов, проанализированных с помощью программы для работы с электронными таблицами или статистического программного обеспечения (рисунок 2C).