JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

نماذج من استعمار الفئران المهبلي بواسطة البكتيريا المزروعة لاهوائيا

Published: May 25, 2022
doi:
10.3791/64032
, , , , ,
1Division of Biology and Biomedical Sciences,Washington University School of Medicine, 2Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences,University of California, 3Glycobiology Research and Training Center,UCSD, 4Department of Pediatrics,Washington University School of Medicine

Summary

يقدم البروتوكول نموذجا للفأر للاستعمار المهبلي مع البكتيريا المهبلية البشرية المزروعة لاهوائيا. نحن نركز على Gardnerella vaginalis ، مع تضمين اقتراحات ل Prevotella bivia و Fusobacterium nucleatum. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول كدليل للتلقيح المهبلي والتعافي القابل للتطبيق للبكتيريا الأخرى المزروعة لاهوائيا.

Abstract

يمكن استعمار مهبل الثدييات بواسطة العديد من الأصناف البكتيرية. غالبا ما تهيمن أنواع Lactobacillus على الميكروبيوم المهبلي البشري ، لكن واحدة من كل أربع نساء تعاني من التهاب المهبل الجرثومي ، حيث يصاحب انخفاض مستوى العصيات اللبنية فرط نمو البكتيريا اللاهوائية المتنوعة. ارتبطت هذه الحالة بالعديد من المضاعفات الصحية ، بما في ذلك المخاطر على الصحة الإنجابية والجنسية. في حين أن هناك أدلة متزايدة تظهر الطبيعة المعقدة للتفاعلات الميكروبية في صحة المهبل البشري ، فإن الأدوار الفردية لهذه البكتيريا اللاهوائية المختلفة ليست مفهومة تماما. هذا معقد بسبب عدم وجود نماذج كافية لدراسة البكتيريا المهبلية المزروعة لاهوائيا. تسمح لنا نماذج الماوس بالتحقيق في بيولوجيا وضراوة هذه الكائنات الحية في الجسم الحي. تم وصف نماذج الفئران الأخرى من التلقيح البكتيري المهبلي سابقا. هنا ، نصف طرق تلقيح البكتيريا المزروعة لاهوائيا واستعادتها القابلة للحياة في الفئران C57Bl / 6 التي يتم تربيتها تقليديا. كما تم وصف طريقة إجرائية جديدة أقل إرهاقا للتلقيح المهبلي والغسيل. يتم تحديد التلقيح والانتعاش القابل للحياة من Gardnerella بالتفصيل ، وتناقش استراتيجيات اللاهوائية الإضافية مثل Prevotella bivia و Fusobacterium nucleatum .

Introduction

في الثدييات ، المهبل هو موطن لمجموعة من الأنواع البكتيرية. الميكروبيوم المهبلي البشري فريد من نوعه بين الثدييات في وفرة أعضاء جنس Lactobacillus وما يقابله من انخفاض درجة الحموضة المهبلية (3.8-4.5) 1،2،3،4. يرتبط اضطراب هيمنة Lactobacillus بمجموعة متنوعة من النتائج الصحية السلبية.

في التهاب المهبل الجرثومي (BV) هناك عدد أقل من العصيات اللبنية وزيادة وفرة البكتيريا اللاهوائية المتنوعة ، مثل Gardnerella vaginalis و Prevotella bivia 5,6. النساء المصابات بالتهاب المهبل الجرثومي معرضات بشكل متزايد لخطر الإصابة بالأمراض المنقولة جنسيا7،8،9 ، والعقم 10 ، وفقدان الحمل 11 ، والولادة المبكرة12،13،14 ، والالتهابات داخل الرحم 15 ، والتهابات عنق الرحم 16 ، والسرطان 16،17،18 . يرتبط BV أيضا باحتمالية أكبر للاستعمار المهبلي بواسطة البكتيريا المسببة للأمراض المحتملة ، مثل Fusobacterium nucleatum1،19،20 ، وهو عزل شائع من عدوى السائل الأمنيوسي 21.

نظرا لأهمية البكتيريا اللاهوائية في صحة المهبل البشري ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا هذه الكائنات الحية وإمراضها. هنا ، نصف طرق التلقيح المهبلي والتعافي القابل للحياة ل Gardnerella vaginalis في الفئران المستروجة ونقترح استراتيجيات إضافية ل Prevotella bivia و Fusobacterium nucleatum. تم وصف نماذج أخرى من الاستعمار المهبلي للفئران سابقا ، لكنها ركزت على تلقيح واستعادة البكتيريا اللاهوائية الاختيارية مثل المجموعة B Streptococcus22 و Neisseria gonorrhoeae23 التي تم استزراعها هوائيا. يمكن تحقيق التلقيح واستعادة اللاهوائيات الملزمة بنجاح باستخدام الاستراتيجيات التجريبية المناسبة. نناقش مناهج الاستعادة القابلة للتطبيق للعديد من الأصناف البكتيرية ونقترح تقييما تجريبيا لظروف بقاء الأنواع / السلالات الإضافية ذات الاهتمام.

الطريقة الكلاسيكية لتقدير الاستعمار بواسطة البكتيريا الحية هي استعادة وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs). في الفئران التي يتم تربيتها تقليديا مع الجراثيم الداخلية الخاصة بها ، يتطلب هذا التعافي على وسائط أجار التي تختار ضد أعضاء الجراثيم المهبلية الداخلية مع السماح لسلالة البكتيريا الملقحة بالنمو. هنا ، نستخدم عزلة مقاومة للستربتومايسين من G. vaginalis24 والتي يمكن استردادها بشكل انتقائي على وسط أجار يحتوي على الستربتومايسين. للتأكد من أن الوسط انتقائي بما فيه الكفاية ، وعلى العكس من ذلك ، أن البكتيريا المقاومة للستربتومايسين غير موجودة في الميكروبيوم الداخلي ، يجب طلاء الغسلات المهبلية التي يتم جمعها قبل التلقيح مباشرة على أجار انتقائي (يحتوي على الستربتومايسين).

قد تختلف أفضل طريقة لإعداد اللقاح بين أنواع وسلالات البكتيريا. قبل بدء التجارب على الفئران ، يجب إجراء العمل الأولي لتحديد الظروف المفضلة لوسط الاستزراع ، ونقطة نهاية النمو ، وإعداد اللقاح ، وكذلك القابلية للأكسجين والجدوى في برنامج تلفزيوني. في حالة البكتيريا الأكثر حساسية للأكسجين، يمكن النظر في الاستعدادات البديلة للقاحي (على سبيل المثال، في وسط ثقافة لاهوائية مع مجموعة تحكم مركبة مناسبة)25,26.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات وإجرائها وفقا للإرشادات المؤسسية ودليل رعاية واستخدام المختبر بجامعة كاليفورنيا سان دييغو (UCSD ، رقم البروتوكول: S20057 ، 2020 فصاعدا) وقبل ذلك في جامعة واشنطن ، سانت لويس (البروتوكول 20110149 ، حتى عام 2020). ملاحظة: يستخدم البروتوكول أدناه إناث C57Bl / الفئران التي يتم تربيتها تقليديا ، والتي يتراوح عمرها بين 6 و 11 أسبوعا في وقت التلقيح. يرجى ملاحظة معلومات البائع والفئات العمرية المحددة المستخدمة سابقا في العمل المذكور ذي الصلة. 1. إعداد وإدارة β-استراديول 17-فاليرات ملاحظة: β-استراديول 17-فاليرات هو مادة مسرطنة وسم تناسلي يمكن امتصاصه من خلال الجلد27,28. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التعامل مع مسحوق ومحلول سائل. وهو أيضا سم مائي29. تخلص منه بشكل صحيح في حاوية محكمة الغلق وملصقة بشكل مناسب. مرشح تعقيم ما يصل إلى 50 مل من زيت السمسم من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر باستخدام نظام مرشح فراغ أنبوب مخروطي 50 مل. افتح فقط في خزانة السلامة الحيوية للحفاظ على العقم. احسب حجم محلول فاليرات β-استراديول اللازم للتجربة: 200 ميكرولتر لكل فأر بالإضافة إلى 2-3 مل إضافية لحساب فقد العينة أثناء ملء المحاقن (على سبيل المثال ، تتطلب تجربة 10 ماوس 4 مل في المجموع). احسب كمية β-استراديول فاليرات اللازمة لصنع محلول 5 مجم / مل وقم بوزنه مباشرة في أنبوب مستدير القاع سعة 14 مل. قم بتغطية الأنبوب سعة 14 مل بإحكام ودوامة لتفتيت الكتل في المسحوق (سيسمح ذلك لفاليرات β-استراديول بالذوبان بسرعة أكبر). أضف زيت السمسم المعقم المصفى إلى أنبوب 14 مل بحيث يكون التركيز النهائي لفاليرات β-استراديول 5 مجم / مل. ضع أنبوب 14 مل المغطى بإحكام على دوار عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة ، حتى يذوب المسحوق الصلب تماما. تأكد بصريا من تجانس الحل قبل الحقن في الفئران. الحضانة عند 37 درجة مئوية تقلل من لزوجة زيت السمسم ، مما يسهل حقنه. ارسم محلول فاليرات β-استراديول في حقنة سعة 1 مل (بدون إبرة). للقيام بذلك دون إدخال فقاعات ، أولا ، ارسم القليل من المحلول ، ثم اطرده برفق مع الحفاظ على طرف المحقنة في زيت السمسم. ارسم المحلول مرة أخرى ببطء ، بعد علامة 100 ميكرولتر قليلا. ضع إبرة 25 جم × 5/8 على المحقنة. بعد ذلك ، قم بتجهيز الإبرة عن طريق طرد محلول زيت السمسم ببطء حتى يبدأ في الخروج من طرف الإبرة. طرد الحل حتى تصبح المحقنة عند علامة 100 ميكرولتر. تحضير حقنة واحدة لكل ماوس. يتم تطبيق β-استراديول 17-فاليرات عن طريق الحقن داخل الصفاق عند 48 ساعة أو 72 ساعة قبل التلقيح. حقن كل فأر مع 100 ميكرولتر من 5 ملغ / مل β-استراديول فاليرات محلول (0.5 ملغ β-استراديول فاليرات / الفأر) ، كما هو موضح سابقا22،30. قم بتخزين المحلول المتبقي في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 72 ساعة حتى الحقن التالي. تطبيق محلول فاليرات β-استراديول مرة أخرى في يوم التلقيح، مباشرة قبل التلقيح المهبلي للفئران. أخرج المحلول من 4 درجات مئوية وضعه على دوار عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الحقن للسماح لزيت السمسم بالدفء ويصبح أقل لزوجة. تابع الحقن كما هو موضح في الخطوة 1.7. 2. إعداد اللقاح ملاحظة: يحتوي هذا القسم على الخطوات العامة لإعداد اللقاح من Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR24،25،31،32،25،32،25،32 لاهوائيا. يجب أن تتم جميع الخطوات في هذا القسم في غرفة لاهوائية. قم بتدوير أي كواشف ، بما في ذلك مرق NYC III المحضر ، والأجار ، و PBS ، في غرفة لاهوائية لتحقيق التوازن قبل 24 ساعة على الأقل من الاستخدام.ملاحظة: هنا ، تم استخدام غرفة لاهوائية من الفينيل متوازنة مع مزيج غاز الهيدروجين بنسبة 5٪. عادة ما يكون تركيز الأكسجين الداخلي عند 0 جزء في المليون ، على الرغم من أنه يمكن أن تكون هناك زيادات عابرة منخفضة المستوى (10-25 جزء في المليون) عند تدوير المواد في الغرفة. قبل يومين من التلقيح المهبلي ، أخرج Gardnerella من مخزون الجلسرين المجمد على صفيحة أجار NYC III في الغرفة اللاهوائية. استخدم وعاءا صغيرا (مثل صندوق رأس ماصة فارغ) مملوءا بالثلج الجاف للحفاظ على مخزون الجلسرين مجمدا أثناء النقل داخل وخارج الغرفة. قبل يوم واحد من التلقيح المهبلي ، استخدم 5-10 مستعمرات Gardnerella فردية من اللوحة لتلقيح 10 مل من مرق NYC III. اترك المزرعة السائلة تنمو طوال الليل لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. قم بتضمين حصة ثانية 1 مل من وسط الاستزراع الذي ترك غير ملقح واحتضانه جنبا إلى جنب مع المزرعة الملقحة للتأكد من أن الوسط غير ملوث. تحضير اللقاح من الثقافة السائلة كما هو موضح أدناه. أداء إعداد اللقاح في الغرفة اللاهوائية قدر الإمكان.أوجد الكثافة البصرية للثقافة (OD) بإضافة 200 ميكرولتر من الثقافة إلى 800 ميكرولتر من الوسائط الطازجة في كوفيت سعة 1.5 مل (تخفيف 1: 5). استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس كثافة (OD) للثقافة المخففة بطول موجي يبلغ 600 نانومتر (استخدم كفيت منفصل مع وسائط جديدة وحدها كفارغة). اضرب قراءة OD في 5 للحصول علىOD 600 الفعلي لثقافة 16 ساعة. احسب حجم اللقاح اللازم للتجربة. على سبيل المثال ، لإصابة 15 فأرا بلقاح 20 ميكرولتر لكل فأر ، هناك حاجة إلى 15 × 20 ميكرولتر = 300 ميكرولتر من اللقاح. تحضير ما يقرب من 25 ٪ من اللقاح أكثر من اللازم ، لذلك بالنسبة ل 15 الفئران ، قم بإعداد 300 ميكرولتر + (0.25 × 300 ميكرولتر) = 375 ميكرولتر من اللقاح. باستخدام OD 600 المحدد في الخطوة 2.4.1 ، احسب حجم ثقافة 16 ساعة التي تحتاج إلى تدويرها وإعادة تعليقها للحصول على لقاح OD600 = 5.0 في الحجم المحسوب في الخطوة 2.4.2. على سبيل المثال ، إذا كان OD600 للثقافة هو 1.5 ، وحجم اللقاح المطلوب هو 375 ميكرولتر ، فإن حجم الثقافة المراد نسجها هو (375 ميكرولتر × 5) / 1.5 = 1250 ميكرولتر. ماصة حجم الثقافة المحسوبة في الخطوة 2.4.3. في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. قم بتكوير البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 1-3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني لاهوائي بالحجم المحسوب في الخطوة 2.4.2. سيكون اللقاح الآن عندOD 600 محسوب من 5.0. إذا كان ذلك ممكنا ، قم أيضا بإعداد أنبوب من PBS ليكون بمثابة عنصر تحكم في السيارة للفئران في المجموعة الضابطة غير المصابة. قبل إزالة أنبوب اللقاح من الغرفة اللاهوائية ، قم بإعداد سلسلة تخفيف تسلسلي من 1:10 حتى 1:10 × 106 في PBS. تتكرر اللوحة الموضعية 5 لكل تخفيف على صفيحة أجار باستخدام ماصة متعددة القنوات لتحديد CFU للقاح. هذا هو CFU قبل التلقيح. 3. المهبل قبل الغسيل والتلقيح مع Gardnerella تحضير أنابيب غسل / غسل المهبل في الغرفة اللاهوائية (يمكن القيام بذلك في نفس وقت تحضير اللقاح في الخطوة 2.4.). ماصة 70 ميكرولتر من PBS المعقمة واللاهوائية في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل تحمل أرقام الماوس. قم بإعداد أنبوب غسيل واحد لكل ماوس. أغلق الأنابيب بإحكام وقم بإخراجها من الغرفة اللاهوائية. قم بإجراء غسل مهبلي على كل فأر باستخدام 50 ميكرولتر من PBS اللاهوائي من الأنابيب الفردية المعدة في الخطوة 3.1. هذه الغسل المهبلي هي غسولات ما قبل التلقيح ويمكن استخدامها للقياسات والمقايسات النهائية.بعد إعطاء حقن فاليرات β-استراديول الثاني (الخطوة 1.8) ، ضع كل فأر فوق قفص أو سطح صلب نظيف يمكنه الإمساك به بأقدامه الأمامية. أمسك الجزء الأوسط من الذيل برفق وارفعه بحيث تكون الأرباع الخلفية مرتفعة قليلا وتنكشف فتحة المهبل. باستخدام ماصة وطرف مرشح p-200 ، اسحب 50 ميكرولتر من PBS من أنبوب الغسيل المقابل للماوس المناسب. أدخل طرف الماصة برفق في تجويف المهبل ~ 2-3 مم ، وماصة حجم 50 ميكرولتر للداخل والخارج برفق ، 3x-4x. انقل مادة الغسيل المجمعة (~ 50 ميكرولتر) مرة أخرى إلى نفس أنبوب الغسيل الذي أتت منه ، مع سحب الأنابيب لأعلى ولأسفل في أنبوب الغسيل الذي لا يزال يحتوي على 20 ميكرولتر المتبقية من PBS. إذا كان هناك مخاط مفرط وانسداد الطرف ، فاستخدم طرف p-200 نظيفا لجمع المواد المتبقية ووضعها في نفس أنبوب الغسيل. قم بإعطاء 20 ميكرولتر من التعليق البكتيري المركز أو التحكم في السيارة عن طريق المهبل لكل فأر. قم بتلقيح كل فأر مباشرة بعد غسل المهبل لهذا الفأر (أي إجراء الغسيل والتلقيح بالتسلسل لكل فأر قبل الانتقال إلى الفأر التالي). لتبسيط هذه العملية ، استخدم ماصة p200 – واحدة مضبوطة على 50 ميكرولتر للغسل والأخرى على 20 ميكرولتر للتلقيح.كبح جماح الماوس كما هو موضح في الخطوة 3.2.1. باستخدام طرف p-200 ، ماصة 20 ميكرولتر من التعليق البكتيري في المهبل. بالنسبة لتجارب التلقيح المشترك باستخدام نوعين / سلالات بكتيرية مختلفة ، استخدم 10 ميكرولتر من كل معلق بكتيري وتجنب خلط السلالتين قبل التلقيح.ملاحظة: يجب ألا يتجاوز حجم التلقيح الكلي 20 ميكرولتر لتجنب انتشار المهبل. استمر في رفع الطرف الخلفي لكل فأر لمدة 10-20 ثانية لمنع الحجم المعطى من التجمع على الفور عند مقدمة المهبل. بعد ذلك ، ضع الماوس في قفص / وعاء جديد أو مع زملائه في القفص الذين تم تلقيحهم بالفعل. كرر الخطوة 3.2. والخطوة 3.3. لكل ماوس. لا تضع الفئران مرة أخرى في قفص مع الحيوانات التي لم يتم تلقيحها بعد. هذا يمنع التعرض غير المقصود للفئران للبكتيريا المقاومة للستربتومايسين قبل التلقيح. بعد تلقيح جميع الفئران ، قم بتدوير أنبوب اللقاح مرة أخرى إلى الغرفة اللاهوائية. قم بإعداد ولوحة تخفيف تسلسلي آخر كما هو موضح في الخطوة 2.5. هذا هو CFU بعد التلقيح. قارن وحدات CFU من لوحات ما بعد التلقيح وما قبل التلقيح لتحديد ما إذا كانت صلاحية اللقاح قد انخفضت أثناء وجوده خارج الغرفة اللاهوائية أثناء تلقيح الحيوانات. لوحة غسل المهبل التي تم جمعها في الخطوة 3.2. على أجار انتقائي (في هذه الحالة ، 1 ملغ / مل ستربتومايسين). احتضان الألواح لمدة 1-2 أيام في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية وفحصها للنمو.ملاحظة: يشير النمو إلى أن الأعضاء الداخلية للميكروبيوم مقاومة لعلامة الاختيار وبالتالي قد تحجب تعداد CFU للكائن المستهدف. 4. جمع من غسل المهبل لتحديد استعمار Gardnerella قابلة للحياة اجمع الغسول المهبلي في نقاط زمنية محددة لتحليل الاستعمار المهبلي. جمع كما هو موضح في الخطوة 3.2. مباشرة بعد الجمع ، قم بتدوير الغسل المهبلي في غرفة لاهوائية. استخدم 10 ميكرولتر من كل غسل لإجراء التخفيف التسلسلي والطلاء على أجار انتقائي كما هو موضح في الخطوة 2.5. استخدام CFU التهم كمقياس للاستعمار المهبلي من قبل Gardnerella (أو لاهوائية أخرى ذات أهمية). 5. التضحية والتشريح وتجانس الأنسجة قم بإعداد أنبوب سعة 5 مل لكل عضو يتم جمعه من كل فأر (على سبيل المثال ، إذا تم جمع المهبل وعنق الرحم والرحم ، فقم بإعداد ثلاثة أنابيب لكل فأر). املأ كل أنبوب ب PBS اللاهوائي المعقم 1x (أو وسائط التجانس الأخرى) في الغرفة اللاهوائية. استخدم 1 مل من PBS للأنابيب المستخدمة لجمع المهبل وعنق الرحم و 750 ميكرولتر للأنابيب المستخدمة لجمع قرون الرحم. بمجرد إضافة PBS ، قم بوزن كل أنبوب على حدة (هذا هو وزن ما قبل التجميع وسيتم استخدامه لتحديد الوزن الإجمالي لكل نسيج تم حصاده). إذا لم يكن الميزان متاحا في الغرفة اللاهوائية ، فقم بتغطية الأنابيب بإحكام وإخراجها من الحجرة المراد وزنها ، ثم قم بتدويرها مرة أخرى.ملاحظة: يمكن إعداد الأنبوب وجمع الوزن قبل 1 يوم من التضحية ، ولكن يجب أن تبقى الأنابيب في الغرفة اللاهوائية مع أغطية مغلقة بإحكام لمنع التبخر. حضري مجموعة من أنابيب غسل المهبل كما هو موضح في الخطوة 3.1. لجمع الغسيل النهائي عند التضحية. أيضا ، قم بإعداد دورق سعة 50 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) ودورق ثان سعة 50 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ -90٪ لاستخدامه في شطف وتعقيم أدوات تشريح الفولاذ القياسية أثناء التضحية. قم بتدوير أنابيب جمع الأعضاء المملوءة ب PBS من الغرفة اللاهوائية. حافظ على الأنابيب مغلقة بإحكام حتى تصبح الأنسجة جاهزة للإضافة. ضحي بكل فأر باستخدام الطرق المعتمدة من IACUC. قم بإجراء الغسيل النهائي كما هو موضح في الخطوات 3.2.2. و3.2.3. إما مباشرة قبل التضحية أو بعدها مباشرة. ابدأ التشريح وجمع الأنسجة. رش أسفل البطن والظهر من كل فأر مع 70 ٪ من الإيثانول. تعقيم مقص في دورق من الإيثانول ، والسماح لهم ليجف ، ومن ثم جعل عمودي واحد قطع تجويف البطن البطني الفأر. استخدم ملقط معقم لسحب الجلد ودفع الأمعاء برفق خارج تجويف الجسم وإلى جانب الحقل المفتوح ، مما يؤدي إلى كشف الجهاز التناسلي.ملاحظة: احرص على عدم ثقب أو ثقب الأمعاء لأنها قد تؤوي بكتيريا مقاومة للستربتومايسين يمكن أن تربك النتائج التجريبية. لجمع الحد الأقصى من الأنسجة المهبلية ، كسر عظم العانة أثناء التشريح. باستخدام مقص معقم ، قم بقص مركز عظم العانة (ارتفاق العانة) مع الحرص على عدم قطع المهبل. باستخدام مجموعتين من الملقط المعقم ، أمسك كل جانب من الحوض واسحب الحوض مفتوحا بشكل جانبي ، مما يعرض الجزء السفلي من المهبل تحته. استخدم الملقط للإمساك بعنق الرحم برفق (بنية أكثر صلابة مقارنة بالأنسجة المحيطة). اسحب عنق الرحم برفق لكشف القولون المخفي خلفه ومتصل ارتباطا وثيقا بالمهبل. استخدم مقص صغير لتحرير المهبل من الأنسجة الضامة الخارجية. افصل المهبل بعناية عن القولون وتجنب ثقب الأمعاء. عند تحريره بالكامل ، قم بإحاطة المهبل عند المقدمة بالمقص والقص لتحريره من جسم الفأر. حافظي على قبضة لطيفة على عنق الرحم أثناء السحب قليلا لجعل قرون الرحم أكثر وضوحا. من ناحية أخرى ، قطع مباشرة تحت المبايض على الجانبين الأيمن والأيسر لتحرير قرون الرحم. قم بإزالة الجهاز التناسلي المفصول الآن من تجويف الجسم وضعه في صفيحة بتري معقمة. باستخدام ماكينة حلاقة ، افصل قرون الرحم وعنق الرحم والمهبل. ضع كل منديل في أنبوب التجميع المسمى الخاص به. إذا كان سيتم جمع السيتوكينات ، ضع الأنابيب على الجليد بعد إضافة الأنسجة. قم بوزن كل أنبوب مرة أخرى بعد إضافة المنديل. هذا هو وزن ما بعد الجمع. اطرح وزن ما قبل الجمع من وزن ما بعد الجمع للحصول على الوزن الإجمالي للأنسجة. استخدم الخالط المحمول باليد لتجانس الأعضاء في أنابيب التجميع الخاصة بهم. بالنسبة إلى Gardnerella JCP8151B ، قم بتنفيذ هذه الخطوة في خزانة السلامة الحيوية (الهوائية) أو الغرفة اللاهوائية.تحضير عدة مجموعات من الأنابيب للغسيل والمعالجة المعقمة للخالط المحمول بين العينات. تأكد من أن كل مجموعة تحتوي على ثلاثة أنابيب مخروطية سعة 50 مل: واحدة مملوءة بماء DI ، وواحدة تحتوي على 70٪ من الإيثانول ، والثالثة مع 1x PBS. قم بإعداد مجموعة منفصلة من أنابيب الغسيل لكل مجموعة علاج للفئران. لتنظيف الخالط ، قم بخفض الشفرات في السائل في كل أنبوب غسيل وأدر الأداة إلى أقصى سرعة. امسك الخالط في كل أنبوب من الأنابيب الثلاثة لمدة 3 ثوان تقريبا. ترتيب الغسيل هو ماء DI (لإزالة الحطام المادي) ، ثم الإيثانول (للتعقيم) ، وأخيرا 1x PBS (لتحييد). رج المسبار على منشفة ورقية أو وسادة طاولة يمكن التخلص منها لإزالة السوائل الزائدة بين كل شطف. بعد الشطف الأولي ، قم بتجانس الأنسجة عن طريق خفض مسبار الخالط إلى أسفل أنبوب التجميع ، وحبس الأنسجة تحته. قم بتشغيل الخالط لطحن الأنسجة ، وحرك المسبار برفق لأعلى ولأسفل حوالي 5x بينما يظل مغمورا. تجانس كل عضو لمدة 15-30 ثانية. بعد إيقاف تشغيل الخالط وإزالته من الأنبوب ، افحص المحتويات بصريا لضمان تعطيل الأنسجة بالكامل. هذا مهم بشكل خاص لعنق الرحم والمهبل ، والتي تفشل في بعض الأحيان في الإمساك بها بواسطة المسبار.ملاحظة: لا بأس إذا كانت بعض الدهون الزائدة على قرون الرحم لا تتجانس تماما. كرر الخطوات 5.14.1.-5.14.4.، وغسل وتعقيم المسبار بين كل عينة. قم بالتبديل إلى مجموعة جديدة من أنابيب الغسيل لكل مجموعة تجريبية. انقل الأنابيب ذات العينات المتجانسة إلى الغرفة اللاهوائية. لتحديد العبء البكتيري لكل نسيج ، قم بإجراء دوامة لطيفة قصيرة للعينة لخلطها ، ثم قم بإزالة 100 ميكرولتر من تجانس الأنسجة للتخفيف التسلسلي والطلاء على أجار انتقائي لتحديد CFU (التخفيف الأول هو 1 × 100). إذا كان الحد الأدنى للكشف مطلوبا ، فقم بإجراء طلاء انتشار 200-250 ميكرولتر من التجانس غير المخفف.

Representative Results

يوضح التمثيل التخطيطي لتجربة مثال بعض الطرق التي يمكن للمرء من خلالها تنفيذ البروتوكول الموصوف (الشكل 1). تحمل بعض الحيوانات ميكروبات داخلية المنشأ في الميكروبات المهبلية التي ستنمو على وسائط غير انتقائية. تعتمد الطرق الموصوفة هنا على العزلات المقاومة للستربتومايسين للسلالات البكتيرية المدروسة ، جنبا إلى جنب مع الوسائط الانتقائية التي تحتوي على الستربتومايسين ، للاختيار ضد البكتيريا الداخلية (الشكل 2 أ ، ب). من الممكن أن تتطور مقاومة الستربتومايسين تلقائيا ، لذا فإن فحص الفئران قبل الإصابة (اليوم 0 يغسل) يمكن أن يساعد في تحديد ما إذا كانت هذه مشكلة. يتم استعادة البكتيريا القابلة للحياة من الغسول المهبلي عن طريق التخفيف التسلسلي والطلاء على وسائط أجار. يمكن أن يستوعب طبق بتري القياسي ما يصل إلى 6 × 6 صفيف من بقع 5 ميكرولتر ، مما يسمح بتعداد التتر البكتيري من ست نقاط متماثلة عبر ستة أوامر من حيث الحجم لكل عينة في حالة استخدام تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف (الشكل 3 أ). يمكن استخدام هذه الطريقة لتعداد عيار البكتيريا التي تتراوح من Gardnerella إلى Prevotella و Fusobacterium (الشكل 3B-D). معا ، تسمح هذه الطرق للمرء باختبار الفرضيات وتقديم تفسيرات حول الاستعمار البكتيري / العدوى في الجهاز التناسلي للأنثى. على سبيل المثال ، أظهرت مقارنة عيار Gardnerella في الغسول المهبلي وتجانس الأنسجة المهبلية التوافق بين هذه الطرق (الشكل 4 أ). وبالمثل ، في نموذج التلقيح المشترك المهبلي ، كانت عيارات Prevotella في أنسجة الرحم أعلى بكثير (حوالي 20 ضعفا) أثناء عدوى Gardnerella المشتركة مقارنة بعدوى Prevotella الأحادية (الشكل 4B). أخيرا ، يمكن مقارنة السلالات البكتيرية من النوع البري مقابل السلالات البكتيرية الطافرة في هذه النماذج لتحديد الأدوار التي تلعبها جينات معينة ومنتجاتها في عمليات استعمار / عدوى الجهاز التناسلي. على سبيل المثال ، أدت سلالة متحولة من Fusobacterium تفتقر إلى القدرة على نقل واستهلاك حمض السياليك الكربوهيدراتي إلى انخفاض مستويات الاستعمار لمدة 3 أيام بعد التلقيح (الشكل 4C). الشكل 1: رسم تخطيطي لتجربة نموذجية33. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: نمو الميكروبات المهبلية للفئران الذاتية على الآجار الانتقائي مقابل الأجار غير الانتقائي. تم وضع الغسل المهبلي من خمس إناث C57Bl / 6 فئران (1-5) على صفيحتين مختلفتين من أجار NYC III وتم تحضينها لاهوائيا. (أ) الصفيحة الموجودة على اليسار لا تحتوي على أي مضادات حيوية، وتسمح بنمو البكتيريا اللاهوائية الداخلية من القناة المهبلية للفئران. (ب) تحتوي الصفيحة الموجودة على اليمين على 1 ملغم/مل من الستربتومايسين، وتنتقص ضد نمو البكتيريا الذاتية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: استعادة G. vaginalis و P. bivia و F. nucleatum CFUs القابلة للحياة من الغسول المهبلي. (أ) وحدات CFU من لقاح G. vaginalis JCP8151B-SmR ، مطلي بنسخة طبق الأصل كسلسلة تخفيف على أجار NYC III. (ب – د) استعادة قابلة للحياة (B) G. vaginalis24 ، (C) P. bivia25 ، و (D) F. nucleatum26 من الغسيل المهبلي للحيوانات أحادية العدوى. لكل رسم بياني (B-D) ، يتم دمج البيانات من تجربتين مستقلتين ، مع 10-15 فأر لكل تجربة24،25،26. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: مزيد من التحليل للاستعمار البكتيري اللاهوائي في نموذج التلقيح المهبلي للفئران . (أ) ترتبط عيار G. المهبلية في الغسول المهبلي بعيار G. vaginalis المستعاد من تجانس الأنسجة المهبلية عند 24 ساعة و 72 ساعة بعد التلقيح (مزيج من تجربتين مستقلتين ، ن = 10 لكل منهما. الدلالة التي يحددها اختبار ارتباط رتبة سبيرمان)24. (ب) تؤدي العدوى المشتركة مع G. vaginalis إلى زيادة عيار P. bivia في أنسجة قرن الرحم مقارنة بالحيوانات أحادية العدوى P. bivia في 48 ساعة بعد التلقيح (مزيج من تجربتين مستقلتين ، كل منهما مع 6-10 فئران لكل مجموعة . الدلالة التي يحددها اختبار Mann-Whitney U ، ** p = 0.0017)25. (C) F. nucleatum الطافر مع ناقل حمض السياليك المعطل (Ω SiaT) قد قلل من التتر في الغسل المهبلي للفئران أحادية العدوى مقارنة بالنوع البري من F. nucleatum عند 72 ساعة بعد التلقيح (مزيج من تجربتين مستقلتين ، كل منهما يحتوي على 10 فئران لكل مجموعة . تم تحديد الأهمية بواسطة اختبار Mann-Whitney U ، ** p < 0.01) 26. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الملف التكميلي 1: أمثلة على الطرق المستخدمة للبكتيريا المهبلية المختلفة التي تزرع في ظل الظروف اللاهوائية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

الطريقة الأكثر أهمية التي يختلف بها النموذج الموصوف هنا عن نماذج التلقيح المهبلي المنشورة سابقا هي استخدام البكتيريا المستزرعة لاهوائيا ، والتي تتطلب اعتبارات خاصة لإعداد لقاح قابل للحياة واستعادة البكتيريا من الفئران. قد تختلف الخطوات المحددة في البروتوكول أعلاه اختلافا طفيفا اعتمادا على الأنواع / سلالة البكتيريا المستخدمة ، كما هو مقترح في الملف التكميلي 1. بالإضافة إلى ذلك ، تصف هذه المخطوطة طريقة إجرائية جديدة لإدارة البكتيريا والغسول المهبلي تتطلب خبرة أقل من جانب الباحث وضبط أقل للفئران. إذا كان المجرب غير مرتاح لشكل ضبط النفس الموضح في الخطوة 3.2. والخطوة 3.3 ، يمكن بدلا من ذلك تقشير الفئران كما هو موضح سابقا34 مع أو بدون تخدير وفقا للتصميم التجريبي وإرشادات IACUC المؤسسية.

أحد التحذيرات المهمة لاستخدام البكتيريا المستزرعة لاهوائيا في نماذج الفئران هو أن بعض الخطوات (مثل أي خطوات تنطوي على حية) يجب أن تتم خارج الغرفة اللاهوائية. لذلك ، فإن أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي تلك التي تتعرض فيها البكتيريا ذات الأهمية لبيئة هوائية ، مثل أثناء تلقيح الفئران. سيتطلب استخدام أي لاهوائية جديدة في هذا النموذج تحقيقا أوليا في قدرته على الحفاظ على صلاحيته عند التعرض للأكسجين (مثل مقارنة وحدات CFU قبل وبعد التلقيح كما هو موضح في الخطوة 2.5. والخطوة 3.4.). اعتمادا على درجة الأكسجين وحساسية PBS للكائن الحي ، ينبغي النظر في طرق مختلفة لإعداد اللقاح (الملف التكميلي 1 ، الخطوة 2.4.5.). بالنسبة للتلقيح باستخدام G. vaginalis JCP8151B ، وجدنا أنه يمكن تحضير أنبوب واحد من اللقاح في PBS واستخدامه لإصابة جميع الفئران. إذا تم استخدام بكتيريا لاهوائية مختلفة أكثر حساسية للأكسجين ، فيمكن بدلا من ذلك تحضير اللقاح في أنابيب منفصلة لكل فأر بحيث لا يلزم فتح / إغلاق الأنبوب بشكل متكرر. وبالمثل ، إذا كانت الأنواع البكتيرية ذات الأهمية أكثر حساسية / أقل قدرة على البقاء على قيد الحياة في برنامج تلفزيوني من G. vaginalis ، فيمكن بدلا من ذلك تحضير التلقيح في وسائط الاستزراع. إذا كان الوسيط المستخدم يحتوي على عوامل اختزال ، مثل وسيط CDC اللاهوائي المستخدم في زراعة Prevotella bivia (الملف التكميلي 1 ، الخطوة 2.1. والخطوة 2.2.) ، فإن البكتيريا ستحصل أيضا على حماية متزايدة من التعرض للأكسجين.

يمكن أيضا النظر في طرق بديلة للتجانس ، مثل ضرب الخرز22,35 ، والذي يتم مع إغلاق غطاء الأنبوب وبالتالي قد يدخل كمية أقل من الأكسجين من الخالط المحمول باليد. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتطلب الكائنات الحية الأكثر حساسية للأكسجين وقت توازن أطول للوسائط. يمكن استخدام مؤشر الأكسجين مثل resazurin للتحقق من الوصول إلى الظروف اللاهوائية (الخطوة 2.1.). قد تؤثر الطرق البديلة مثل الجرار اللاهوائية على النتائج ويجب فحصها للتأكد من صلاحيتها للبكتيريا قبل الاستخدام.

قد تلعب حساسية الأكسجين وسرعة الكائن التجريبي أيضا دورا في الاسترداد الناجح للبكتيريا القابلة للحياة من الفأر أثناء الغسل / التجانس (الملف التكميلي 1 ، الخطوة 3.2. والخطوة 5.1). بالنسبة للكائنات شديدة الحساسية ، قد يؤدي الوقت بين الغسل الذي يتم أخذه والطلاء إلى فقدان الصلاحية ويسبب تقديرا منخفضا بشكل مصطنع للاستعمار المهبلي البكتيري. للتخفيف من هذا التأثير ، يمكن تخفيف الغسل الذي تم جمعه على الفور إلى وسائط استزراع لاهوائية جديدة (مع عامل اختزال). وبالمثل ، يمكن إجراء تجانس الأعضاء في وسائط زراعة جديدة بدلا من PBS لزيادة قابلية البكتيريا ويمكن أيضا القيام به في الغرفة اللاهوائية نفسها لتقليل التعرض للأكسجين.

اعتمادا على الغرض من تجربة معينة ، يجب على المجرب الانتباه إلى مجموعات التحكم. لاختبار الفرضيات ، ستساعد المقاييس الأساسية للفئران الضابطة غير المصابة التي يتم علاجها بالمركبة وحدها في تحديد ما إذا كان هناك تحريض للكيموكينات / السيتوكينات أو نتائج محددة أخرى للعدوى. يجب أن تكون مركبة التحكم المستخدمة هي نفس السيارة المستخدمة للتلقيح، لذلك إذا تم تلقيح البكتيريا في وسط الاستزراع، فيجب استخدام وسائط الاستزراع غير الملقحة كعنصر تحكم (الملف التكميلي 1، الخطوة 2.4.5).

يمكن أيضا تطبيق الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول على البكتيريا الاختيارية القادرة على النمو لاهوائيا ولكن يتم دراستها تقليديا باستخدام ظروف الاستزراع الهوائي (مثل الإشريكية القولونية أو المجموعة ب العقدية). قد يكون هذا مناسبا بشكل خاص للعدوى التي تسببها هذه الكائنات الحية في مواقع الجسم التي يعتقد أنها تحتوي على مستويات منخفضة من الأكسجين ، مثل عنق الرحم. قد يكون الكائن الاختياري أكثر نجاحا يصيب المواقع بكمية أقل من الأكسجين عندما يتم تحضير اللقاح لاهوائيا مقارنة بالهواء. في مثل هذه التجربة ، قد لا يتطلب استرداد البكتيريا القابلة للحياة لتعداد CFU ظروفا لاهوائية.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نعترف بلين فوستر للمساعدة الفنية أثناء تطوير هذه النماذج. نحن نقدر أموال بدء التشغيل من قسم علم الأحياء الدقيقة الجزيئية ومركز أبحاث الأمراض المعدية للمرأة (إلى AL) ، و March of Dimes (جائزة باسل أوكونور ل AL) التي ساعدت في دعم تجارب المرحلة المبكرة. كما دعم المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (R01 AI114635) تطوير هذه النماذج.

Materials

β-estradiol 17-valerate Sigma E1631 estrogenization of mice
0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter Fisher  SCGP00525 sterile filtering sesame oil
14 mL tube Falcon 352059 estrogenization of mice
190-proof ethanol Koptec  V1105M dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media
1x PBS Fisher MT21040CM vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization
25 G × 5/8 -in needle BD 305122 estrogenization of mice
5 mL tube Falcon 352063 Tissue collection and homogenization
Anaerobic chamber Coy 7200000 Growth of anaerobic bacteria
Bacto agar Fisher DF0140074 G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates
Bacto peptone Fisher DF0118170 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Columbia broth Fisher DF0944170 Columbia media for F. nucleatum growth
Defibrinated sheep blood Hemostat DSB500 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Forceps Fine Science Tools  11008-13 mouse/tissue dissection
Glucose Sigma G7528 NYCIII media for G. vaginalis growth
Handheld homogenizer ISC Bio 3305500 Tissue homogenization
Hemin Sigma 51280 CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth
HEPES Cellgro 25-060-Cl NYCIII media for G. vaginalis growth
Horse serum Hemostat SHS500 NYCIII media for G. vaginalis growth
Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) Matheson Gas for anaerobic chamber
Isofluorane VetOne 502017 mouse anaethesia at sacrifice
L-cysteine Sigma C1276 CDC anaerobic media for P. bivia growth
L-glutamate Sigma G1626 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 for making media and homogenization
NaCl Sigma S3014 NYCIII media for G. vaginalis growth
NaOH tablets Sigma S5881 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Nitrogen gas  Airgas  Gas for anaerobic chamber
p-200 filter tips ISC Bio  P-1237-200 vaginal lavages and bacterial inoculations
pancreatic digest of casein Sigma 70169 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Proteose peptone #3 Fisher DF-122-17-4 NYCIII media for G. vaginalis growth
Scissors Fine Science Tools  14084-08 mouse/tissue dissection
Sesame oil Fisher  ICN15662191 estrogenization of mice
Single edge surgical carbon steel razor blades VWR 55411-050 tissue dissection
Sodium chloride Sigma S3014 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
Streptomycin Gibco 11860038 add to agar media to make selective plates
Tuberculin slip tip 1ml syringe BD 309659 estrogenization of mice
Vitaim K3 Sigma M5625 Columbia media for F. nucleatum growth
Vitamin K1 Sigma 95271 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Yeast extract Fisher DF0127-17-9 NYCIII media for G. vaginalis growth
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, 273-281 (1993).
  2. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).
  3. Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K. Bacteriology of the vagina. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 86, 23-39 (1984).
  4. van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
  5. Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
  6. Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
  7. Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
  8. Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
  9. Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
  10. Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
  11. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  12. Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
  13. DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
  14. Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
  15. Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
  16. Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
  17. Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
  18. Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
  19. Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
  20. Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
  21. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Seminars in Fetal and Neonatal. 17 (1), 2-11 (2012).
  22. Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
  23. Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
  24. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  25. Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
  26. Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
  27. Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
  28. Yager, J. D., Davidson, N. E. Estrogen carcinogenesis in breast cancer. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 270-282 (2006).
  29. Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Journal of Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
  32. Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
  33. Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022)
  34. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  35. Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).

Tags

Anaerobic BacteriaVaginal ColonizationMurine ModelInoculationVaginal LavageColony-forming UnitsObligate AnaerobesFastidious BacteriaSpectrophotometryAnaerobic Conditions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Morrill, S. R., Agarwal, K., Saha, S., Lewis, W. G., Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria. J. Vis. Exp. (183), e64032, doi:10.3791/64032 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image