בדיקת CAM-Delam לציון תכונות גרורתיות על ידי כימות דלמינציה ויכולת פלישה של תאים סרטניים
Summary
בדיקת CAM-Delam להערכת היכולת הגרורתית של תאים סרטניים היא מהירה יחסית, קלה וזולה. השיטה יכולה לשמש לחשיפת המנגנונים המולקולריים המווסתים את היווצרות הגרורות ולבדיקת תרופות. בדיקה אופטימלית לניתוח דגימות גידול אנושיות יכולה להיות שיטה קלינית לטיפול מותאם אישית בסרטן.
Abstract
הגורם העיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן הוא היווצרות גרורות (כלומר, כאשר תאים סרטניים מתפשטים מהגידול הראשוני לאיברים מרוחקים ויוצרים גידולים משניים). דלמינציה, המוגדרת כהתפרקות של הלמינה הבסיסית וקרום המרתף, היא התהליך הראשוני המאפשר את ההעברה וההתפשטות של תאים סרטניים לרקמות ואיברים אחרים. ניקוד יכולת ההזיה של תאים סרטניים יצביע על הפוטנציאל הגרורתי של תאים אלה.
פיתחנו שיטה סטנדרטית, הבדיקה ex ovo CAM-Delam, כדי לדמיין ולכמת את היכולת של תאים סרטניים לדה-אמין ולפלוש, ובכך להיות מסוגלים להעריך אגרסיביות גרורתית. בקצרה, שיטת CAM-Delam כוללת זריעת תאים סרטניים בטבעות סיליקון על קרום האפרוחכוריאלנטואי (CAM) ביום העוברי 10, ולאחר מכן דגירה משעות עד כמה ימים. בדיקת CAM-Delam כוללת שימוש בתא לחות פנימי במהלך דגירה של עובר אפרוח. גישה חדשנית זו הגדילה את הישרדות העוברים מ-10%-50% ל-80%-90%, מה שפתר בעיות טכניות קודמות עם שיעורי הישרדות נמוכים של עוברים במבחני CAM שונים.
לאחר מכן, דגימות CAM עם אשכולות תאים סרטניים קשורים בודדו, תוקנו והוקפאו. לבסוף, דגימות שעברו חתך קריוסטאט צולמו ונותחו לצורך פגיעה בקרום המרתף ופלישה לתאים סרטניים באמצעות אימונוהיסטוכימיה. על-ידי הערכת קווי תאים סרטניים גרורתיים ולא גרורתיים ידועים שונים שנועדו לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), התוצאות הכמותיות של CAM-Delam הראו כי דפוסי יכולת ההפחתה משקפים אגרסיביות גרורתית וניתן לדרג אותם לארבע קטגוריות. שימוש עתידי במבחן זה, מלבד כימות יכולת ההפלה כאינדיקציה לאגרסיביות גרורתית, הוא לפענח את המנגנונים המולקולריים השולטים ב-delamination, בפלישה, ביצירת מיקרו-מטסטזות ובשינויים במיקרו-סביבה של הגידול.
Introduction
כ -90% מהתמותה בחולי סרטן נגרמת על ידי ההשלכות של גרורות סרטן, שהיא היווצרות של גידולים משניים בחלקים אחרים של הגוף שממנו הסרטן במקור מקורו1. לכן, חשוב לזהות מנגנונים הקשורים לגרורות כדי למצוא מטרות פוטנציאליות לדיכוי היווצרות גרורות סרטניות. לאחר מכן, יש צורך במערכות מודל שבהן ניתן להעריך את התהליך הגרורתי.
במהלך גרורות, תאים סרטניים עוברים מעבר אפיתל-למזנכימלי (EMT), תהליך תאי תקין שבו תאי אפיתל מאבדים את דבקותם ואת תכונות הקוטביות שלהם ובמקום זאת רוכשים אופי מזנכימלי פולשני2. דלמינציה היא חלק מתהליך ה-EMT וכרוכה בהתפרקות של למינין בקרום המרתף, המהווה תנאי מוקדם לתאים סרטניים לעזוב את הגידול הראשוני ולפלוש לרקמות אחרות. הגורמים העיקריים המווסתים במהלך היווצרות גרורות כוללים מטלופרוטינזות מטריצה (MMPs), ADAM (דיסינטרגין ומטאלופרוטינאז), ADAMTS (ADAM עם מוטיבים של טרומבוספונדין) ו-MMPs מסוג ממברנה (MT-MMPs)3,4. גורמים אלה מפרקים מולקולות כגון למינין, המתבטא בכל ממברנות המרתף, כדי להקל על נדידת תאים ופלישה.
קרום chorioallantoic (CAM) של ביצית אפרוח מופרה הוא סוג של קרום מרתף. ביצי אפרוח מופרות שימשו כמודלים גרורתיים, שבהם תאים סרטניים נזרעו על CAM החוץ-אמבריוני ומאוחר יותר היווצרות גרורות שנצפתה בעוברי האפרוח5. יתר על כן, מודלים גרורתיים של עכברים in vivo משמשים לעתים קרובות, שבהם תאים סרטניים מושתלים בעכברים וגרורות באיברים שונים מנותחים6. גישה זו גוזלת זמן רב, יקרה, ועלולה לגרום לאי נוחות עבור בעלי החיים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו את מבחן CAM-Delam, מודל מהיר וזול יותר להערכת האגרסיביות הגרורתית של תאים סרטניים. במודל זה, היכולת של תאים סרטניים לפרק את ה-CAM של האפרוח (למשל, יכולת ההפחתה) משולבת עם פלישה פוטנציאלית של תאים סרטניים לתוך המזנכים ומשמשת כמדידה של אגרסיביות גרורתית.
המאמר הנוכחי, המבוסס על פרסום קודם7, מתאר את בדיקת CAM-Delam בפירוט, החל מטיפול בביצי אפרוח מופרות, תרבית תאים סרטניים וזריעה, כריתה וניתוח של דגימות CAM, וכלה בניקוד יכולת ההפחתה של תאים סרטניים לארבע קטגוריות: שלמים, משתנים, פגומים ופלישה. אנו גם נותנים דוגמאות לאופן שבו ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים המווסתים את תהליך ההפחתה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר את מבחן CAM-Delam כדי להעריך את האגרסיביות הגרורתית של תאים סרטניים, שנקבעה על ידי ניקוד אפנון למינה בסיסית ופלישה פוטנציאלית של תאים לתוך המזנכים תוך פרק זמן של שעות עד כמה ימים. בעיה טכנית קודמת עבור מבחני CAM שונים הייתה ההישרדות הנמוכה של עוברי אפרוחים. בעיה זו נפתרה על ידי הכנסת השימוש בתא לחות פנימי במהלך הדגירה של העובר, מה שהגדיל את הישרדות העוברים מ-10%-50% ל-80%-90%7. השימוש בתא לחות פנימי עשוי, אם כן, להיות בעל ערך במבחני CAM באופן כללי, כמו גם בניסויים אחרים של אפרוחי אובו לשעבר.
נקודות זמן הניקוד המוצגות ב-14 שעות, 1.5 ימים, 2.5 ימים ו-3.5 ימים לאחר זריעה של 1 x 106 תאים סרטניים ב-CAM מבוססות על פיתוח שיטה קפדנית באמצעות שישה קווי תאים סרטניים שונים, והן מספיקות כדי להבחין בטווח שבין אי-הפחתה ליכולות של אי-הפחתה ליכולות של תאי סרטן. מוצע שימוש מינימלי בארבע ביצים עם שלוש טבעות בכל נקודת זמן ובכל קו תא, ויש לחזור על כך לפחות פעם אחת או על פי תכנוני הניסוי והדרישות הסטטיסטיות. אחד היתרונות של בדיקת CAM-Delam הוא השגת תוצאות אינפורמטיביות לגבי יכולת ההפחתה של תאים סרטניים תוך מספר ימים כדי להעריך את האגרסיביות של תאים סרטניים ואת הסיכון הפוטנציאלי להיווצרות גרורות. המסירה המהירה של התוצאות מתאפשרת על ידי ניטור ההשפלה של הלמינה הבסיסית עקב תאי הסרטן הפולשים והמיקרוטומורים / ניצני הגידול וגרורות האיברים הבאים. באופן מסורתי, מודלים CAM שימשו כדי לנתח את היווצרות של גרורות איברים, אשר לוקח כ 2 שבועות כדי להיקבע9. על ידי שימוש בשבעה קווי תאים סרטניים שונים, אימתנו בעבר7 כי ניקוד ההדלאה קשור ליכולתם של תאים סרטניים ליצור גרורות במודלים של מכרסמים 10,11,12,13,14, מה שתומך בערך הניבוי של מבחן CAM-Delam. יתר על כן, מודלים של עכברים דורשים זמן ארוך עוד יותר, מספר שבועות עד חודשים, לפני שניתן יהיה לבחון גרורות 15,16. בקצרה, בדיקת CAM-Delam מפותחת זו, המתמקדת בניקוד יכולת ההדלציה ולא בבחינת היווצרות גידול מאוחרת יותר בעובר האפרוח, היא, אם כן, השלמה טובה למודלים קיימים של פלישת עוף CAM וגידולי עכברים.
מגבלה בבדיקת CAM-Delam עשויה להיות הדמיה לא ברורה של הלמינה הבסיסית אם התאים הסרטניים עצמם מבטאים למינין. אם כן, סמנים אחרים המציינים את הלמינה הבסיסית, כגון E-cadherin, יכולים לשמש7. מחקרי פלישת CAM אחרים השתמשו בקולגן מסוג IV כדי לדמיין את CAM ואת הפאן-ציטוקראטין והווימנטין כדי לזהות תאים סרטניים פולשים ואת היווצרותם של מיקרוטומורים/ניצני גידול17,18.
דלמינציה היא תהליך תאי תקין, הן במהלך ההתפתחות והן בשלב מאוחר יותר בחיים, מה שמאפשר לתאים לעזוב אפיתל ולנדוד לרקמות אחרות. דוגמאות לתאים מתכלים במהלך ההתפתחות הן תאי עצב עצביים וחוש הריח החלוציים19,20; מאוחר יותר בחיים, ריפוי פצעים תלוי בהדלאה21. במהלך הסרטן, תהליך זה מווסת בתאים הלא נכונים ו/או בזמן הלא נכון. לפיכך, שיטת CAM-Delam יכולה לשמש כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים המווסתים את ההדחה, אשר תהיה בעלת חשיבות הן לידע ביולוגי בסיסי והן לידע במחלות. מחקרי דלמינציה כאלה יכללו הוספת גורמים בעלי עניין לתאים הסרטניים שנזרעו על ה-CAM או חקר תאים סרטניים מהונדסים גנטית. דוגמה אחת המוצגת כאן היא טיפול מקדים של CoCl2 של קו התאים הלא גרורתיים U251 כדי לגרום להיפוקסיה, מה שמוביל להשראת יכולת אגרסיבית גרורתית שיכולה להיות מדוכאת על ידי מעכב MMP רחב טווח. לפיכך, מציאת מולקולות מפתח השולטות בהתפרקות מגדילה את האפשרות לתכנן מעכבים כדי לדכא את התהליך הזה. בהקשר זה, שימוש פוטנציאלי נוסף בפרוטוקול CAM-Delam הוא בבדיקת סמים לדיכוי ההזיה והפלישה לתאים. יתר על כן, במרפאה, הערכת חומרת הסרטן היא מרכיב קריטי לאבחון, תכנון טיפול וטיפול. נכון לעכשיו, מערכת ההיערכות TNM (T, גודל הגידול; N, צומת-האם הסרטן התפשט לבלוטות הלימפה; M, גרורות מרוחקות) משמש להערכת חומרת הסרטן22. בדיקת CAM-Delam מגדירה גישה חדשנית להערכת האגרסיביות של תאים סרטניים והסיכון הפוטנציאלי להיווצרות גרורות ועשויה להוות השלמה שימושית למערכת ההיערכות TNM. ראויה לציון העובדה שהיערכות TNM מבוססת על ניתוחים של דגימות רקמות קבועות, בעוד שגישת CAM-Delam קלינית פוטנציאלית תבחן רקמה טרייה או טרייה-קפואה בשילוב עם טכניקות להחייאת תאים קפואים23.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחוקרים הבאים באוניברסיטת אומאו על עזרתם בקווים ונוגדנים רלוונטיים של תאי סרטן: ל. קרלסון (נוגדן מפעל פון וילברנד), ג’יי גילת’ורפ (U251) ומ’ לנדסטרום (PC-3U). אנו מודים גם להוקה הולתוסן במעבדת גילת’ורפ על יצירת קו התאים היציבים HEK293-TLR-AAVS1. העבודה במעבדת Gunhaga נתמכה על ידי הקרן השוודית לסרטן (18 0463), חממת הביוטק Umeå, Norrlands Cancerforskningsfond, מועצת המחקר השוודית (2017-01430) והפקולטה לרפואה באוניברסיטת אומאו.
Materials
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
- Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
- Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
- Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
- Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).
- Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P. Zebrafish von Willebrand factor. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (4), 326-333 (2010).
- Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
- Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
- Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
- Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
- Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
- Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895 (2019).
- Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
- Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
