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Immunologie et infection

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Published: July 27, 2022
doi:
10.3791/63980
, , ,
1Department of Biology,San Diego State University, 2School of Biological Sciences,University of California, San Diego

Summary

Darmmikroben, einschließlich extrazellulärer Bakterien und intrazellulärer Krankheitserreger wie dem Orsay-Virus und Mikrosporidien (Pilze), sind oft mit wilden Caenorhabditis-Nematoden assoziiert. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroben vor, die C. elegans-Nematoden besiedeln und/oder infizieren, und zur Messung der Erregerlast nach kontrollierten Infektionen im Labor.

Abstract

Der Darm wilder Caenorhabditis-Nematoden wird von einer Vielzahl von Mikroorganismen bewohnt, darunter Darmmikrobiombakterien und Krankheitserreger wie Mikrosporidien und Viren. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen Caenorhabditis elegans und Säugetier-Darmzellen sowie der Leistungsfähigkeit des C. elegans-Systems hat sich dieser Wirt als Modellsystem zur Untersuchung von Darm-Mikroben-Interaktionen zwischen Wirt und Mikroben in vivo herausgestellt. Während es möglich ist, einige Aspekte dieser Wechselwirkungen mit der Hellfeldmikroskopie zu beobachten, ist es schwierig, Mikroben genau zu klassifizieren und das Ausmaß der Besiedlung oder Infektion ohne genauere Werkzeuge zu charakterisieren. Die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kann als Werkzeug verwendet werden, um Mikroben in Nematoden aus der Wildnis zu identifizieren und sichtbar zu machen oder um Infektionen de Nematoden, die mit Mikroben infiziert sind, im Labor experimentell zu charakterisieren und zu quantifizieren. FISH-Sonden, die die sehr häufige ribosomale RNA der kleinen Untereinheit markieren, erzeugen ein helles Signal für Bakterien und Mikrosporidienzellen. Sonden, die entwickelt wurden, um konservierte Regionen ribosomaler RNA anzusprechen, die vielen Arten gemeinsam sind, können ein breites Spektrum von Mikroben nachweisen, während das Targeting divergenter Regionen der ribosomalen RNA für eine engere Detektion nützlich ist. In ähnlicher Weise können Sonden entworfen werden, um virale RNA zu markieren. Ein Protokoll für die RNA FISH-Färbung mit Paraformaldehyd (PFA) oder Acetonfixierung wird vorgestellt. Die PFA-Fixierung ist ideal für Nematoden, die mit Bakterien, Mikrosporidien und Viren assoziiert sind, während die Acetonfixierung für die Visualisierung von Mikrosporidasporen erforderlich ist. Die Tiere wurden zuerst gewaschen und in Paraformaldehyd oder Aceton fixiert. Nach der Fixierung wurden FISH-Sonden mit Proben inkubiert, um die Hybridisierung der Sonden zum gewünschten Ziel zu ermöglichen. Die Tiere wurden erneut gewaschen und anschließend auf Objektträgern oder mit automatisierten Ansätzen untersucht. Insgesamt ermöglicht dieses FISH-Protokoll die Erkennung, Identifizierung und Quantifizierung der Mikroben, die den Darm von C. elegans bewohnen, einschließlich Mikroben, für die keine genetischen Werkzeuge verfügbar sind.

Introduction

Caenorhabditis elegans hat sich als leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung der angeborenen Immunität und der Wirt-Mikroben-Interaktionen in den Darmepithelzellen erwiesen 1,2. Aufgrund eines transparenten Körpers und nur 20 Darmzellen stellt C. elegans ein komfortables System zur Überwachung der Prozesse der mikrobiellen Darmbesiedlung und Infektion im Kontext eines intakten Organismus dar. Nematoden-Darmzellen haben multiple morphologische und funktionelle Ähnlichkeiten mit Darmepithelzellen von Säugetieren, was sie zu einem handhabbaren In-vivo-Modell für die Dissektion von Prozessen macht, die die Mikrobiombesiedlung und die Infektion mit Krankheitserregern steuern 3,4,5,6.

Wilde C. elegans ernähren sich von einer Vielzahl von Mikroben, die den Darm besiedeln und infizieren, und die Probenahme dieser Nematoden hat zur Entdeckung von Viren, Eukaryoten (Pilzen, Oomyceten) und Bakterien geführt, die sich natürlich mit diesem Wirt verbinden 7,8,9,10. Das Orsay-Virus infiziert den Darm und ist derzeit das einzige bekannte natürliche Virus von C. elegans9. Mikrosporidien sind pilzbedingte obligate intrazelluläre Erreger, die die am häufigsten gefundene Infektion bei wild gefangener Caenorhabditis sind, wobei mehrere Arten entdeckt wurden, die C. elegans und verwandte Nematoden infizieren 8,11. Viele Bakterien werden häufig im Darmlumen von wild gefangenen C. elegans gefunden, und mehrere Arten wurden als natürliches Modell für das C. elegans-Mikrobiom (CeMbio) etabliert6,12,13,14. Die Entdeckung und Charakterisierung von Mikroben, die C. elegans auf natürliche Weise besiedeln und/oder infizieren, ist unerlässlich, um die genetischen Mechanismen zu verstehen, die diese Wirt-Mikroben-Interaktionen steuern, sowie um neuartige mikrobielle Prozesse zu visualisieren, die nur im Kontext eines intakten Wirtstiers auftreten.

Nach der Probenahme werden wilde Nematoden mittels DIC-Mikroskopie (Differential Interference Contrast) nach Phänotypen gesucht, die auf eine Infektion oder Besiedlung hinweisen. Zum Beispiel können Veränderungen im stereotypen granulierten Erscheinungsbild der Darmzellen mit dem Vorhandensein einer intrazellulären Parasiteninfektion assoziiert sein8. Insbesondere der Verlust des Darmgranulats und eine verminderte zytosolische Viskosität sind Anzeichen einer Virusinfektion, während die Reorganisation des Darmgranulats in “Rillen” auf eine Infektion mit Mikrosporidien der Gattung Nematocida 8,9 hinweisen kann. Da in wilden C. elegans-Proben eine Vielzahl von Mikroben vorhanden sind, kann es schwierig sein, Mikroben durch DIC-Mikroskopie zu unterscheiden. Informationen über die räumliche Verteilung von Mikroben innerhalb des Wirts können aufgrund der geringen Größe vieler Mikroben ebenfalls schwer zu erkennen sein15. Darüber hinaus ist die Kultivierung bestimmter Mikroben von Interesse in vitro nicht immer möglich, was zu Schwierigkeiten beim Nachweis und/oder der Quantifizierung führt.

Die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) bietet eine Methode zur fluoreszierenden Markierung von Mikroben unter Verwendung von Fluoreszenzsonden, die an die RNA der kleinen ribosomalen Untereinheit (SSU) de festen Zellen binden. Wenn die Analyse morphologischer Merkmale auf eine bestimmte Klasse von Mikroben hindeutet, können FISH-Sonden verwendet werden, die auf spezifische oder breite Klassen solcher Mikroben abzielen. Zum Beispiel gilt EUB338 als universelle Sonde für die bakterielle SSU und wird häufig zum Nachweis einer Vielzahl von Bakterienverwendet 16. Das hier beschriebene Protokoll verwendet einzelsträngige DNA-Sonden, die mit einem Fluorophor endmarkiert sind und speziell so konzipiert sind, dass sie die Ziel-SSU der interessierenden Mikrobe ergänzen, obwohl zuvor entworfene Sonden verfügbar sind16. Der Hauptvorteil des Ziels auf die SSU von Mikroben ist die relativ große Häufigkeit dieser RNA, die typischerweise 80%-90% der gesamten RNA in der Zelle ausmacht, was zu einer Färbung mit einem sehr hohen Signal-Rausch-Verhältnis führt17. Sonden können auch so konzipiert werden, dass sie RNA zum Nachweis von Viren wie dem Orsay-Virus 9,18 anvisieren, die oft in sehr hohen Kopien in infizierten Zellen vorhanden sind, wenn sich das Virus aktiv repliziert.

Abhängig von den Ergebnissen mit bekannten Sonden kann es notwendig sein, weitere Sequenzinformationen zu erhalten, um spezifischere Sonden für die Speziesbestätigung in situ zu entwerfen. Ein gängiger Ansatz besteht darin, universelle Primer gegen konservierte Regionen der SSU (16S für Bakterien und 18S für Eukaryoten) zu verwenden, um (über PCR) Regionen zu amplifizieren, die divergenter sind8. Mit Hilfe dieser Sequenzinformationen können Sonden mit mehr Speziesspezifität entworfen werden. Diese FISH-Sonden können dann die kulturunabhängige Identifizierung von Mikroben ermöglichen8. Darüber hinaus kann RNA FISH Einblicke in einzigartige morphologische Besiedlungs- und Infektionsmerkmale geben, einschließlich Filamentation oder Gewebelokalisationsmuster19,20. Verschiedene farbige FISH-Sonden können gleichzeitig verwendet werden, was eine visuelle Unterscheidung zwischen Mikroben in wilden Nematodenproben sowie die Beobachtung der Mikroben-Mikroben-Dynamik innerhalb eines Wirtsermöglicht 15,20. Darüber hinaus kann die RNA-FISH-Färbung auf Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien angewendet werden, bei denen Infektion und Besiedlung einer bekannten Art leicht manuell oder durch automatisierte Ansätze quantifiziert werden können, um Einblicke in die Erregerlast zu erhalten, beispielsweise beim Vergleich von C. elegans-Mutanten, die entweder eine erhöhte oder verminderte Resistenz gegen Infektionen aufweisen21.

Protocol

HINWEIS: Nematoden können entweder mit Paraformaldehydlösung (PFA) oder Aceton fixiert werden. PFA ermöglicht eine bessere Visualisierung der Morphologie als Aceton und kann Signale von transgenem grün fluoreszierendem Protein (GFP) erhalten, das durch Aceton zerstört wird. Eine Acetonfixierung ist jedoch notwendig, um Mikrosporidiensporen zu permeabilisieren, um dieses Lebensstadium markieren zu können. Darüber hinaus kann Aceton bequemer sein als PFA, da es weniger giftig ist, und Proben können mehrere Tage in Aceton in einem -20 ° C Gefrierschrank gelagert werden, ohne dass das Fixiermittel entfernt werden muss. Im Folgenden finden Sie zwei separate Protokolle, die entweder PFA-Lösung oder Aceton als Fixiermittel verwenden. Eine Visualisierung der Protokollschritte finden Sie in Abbildung 1. 1. FISH-Färbung mit PFA-Fixierung Nematoden mit assoziierten Mikroben vorbereitenZüchten Sie Nematoden mit der gewünschten Mikrobe von Interesse auf Standard-Nematodenwachstumsmedien (NGM) -Platten, die mit der entsprechenden Nahrungsquelle ausgesät sind. Die Nematoden bei 20 °C inkubieren, bis das gewünschte Lebensstadium erreicht ist. Fügen Sie 2 mL M9 minimale Salzmedien (42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH2PO 4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH 4 Cl) + 0,1% Tween 20 zu NGM Platten hinzu, die den Caenorhabditis-Stamm enthalten, der mit der gewünschten zu visualisierenden Mikrobe infiziert oder besiedelt ist.HINWEIS: Die Zugabe von Reinigungsmittel soll verhindern, dass Nematoden an Pipetten und Mikrofugenröhrchen haften und die Pelletierung von L1-L2-Nematoden unterstützen. 0,1% Triton-X kann anstelle von Tween 20 verwendet werden. Pipettieren Sie die Nematoden mit einer Pasteur-Pipette und einem Kolben aus Glas von den Platten und geben Sie sie in markierte 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen.HINWEIS: Glaspipetten werden bevorzugt, da Nematoden an Kunststoffpipetten haften können, aber die Zugabe von Reinigungsmittel (Tween 20 oder Triton-X) kann dieses Problem minimieren. Mit einer Mikrozentrifuge werden die Proben, die die kolonisierten oder infizierten Nematoden enthalten, bei 2.000 x g für 60 s für L1-Tiere oder 500 x g für 60 s für L4-Tiere oder erwachsene Tiere heruntergedreht. Alle nachfolgenden Zentrifugationsschritte werden mit der gewählten Geschwindigkeit durchgeführt. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette aus den Mikrofugenröhrchen. Vermeiden Sie es, das Nematodenpellet zu stören, indem Sie den Überstand vorsichtig bis zu 100 μL über dem Pellet entfernen. Dies kann anhand von markierten 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen geschätzt werden. Nematoden waschen, um externe Verunreinigungen zu vermeiden1 mL 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) + 0,1% Tween 20 (PBS-T) in Mikrofugenröhrchen geben. Die Proben werden in einer Mikrozentrifuge mit der entsprechenden Geschwindigkeit heruntergedreht (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie mit einer Pipette alle bis auf 100 μL des Überstands. Dies kann anhand von markierten 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen geschätzt werden. Wiederholen Sie die beiden obigen Schritte 2-3x.HINWEIS: Drei Gesamtwäschen sind in der Regel ausreichend; Es können jedoch zusätzliche Wäschen durchgeführt werden, um überschüssige externe Verunreinigungen zu entfernen. Nematoden mit PFA fixierenIn den Abzug werden 33 μL 16% PFA in das Mikrofugenröhrchen gegeben, das 100 μL Überstand über dem aus Schritt 1.2.3 erhaltenen Nematodenpellet enthält, um eine Endkonzentration von 4% PFA zu erreichen.ACHTUNG: PFA ist ein Karzinogen. Der Kontakt mit PFA kann zu Hautsensibilisierung und -reizungen sowie Augenschäden führen. PFA setzt giftige Dämpfe frei, die zu Reizungen oder Sensibilisierungen der Atemwege führen können. Arbeiten Sie bei der Verwendung von PFA in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und beachten Sie vor Gebrauch die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter. Inkubieren Sie die Proben, die die mit der interessierenden Mikrobe besiedelten oder infizierten Nematoden enthalten, für 30-45 min bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation lagern Sie die Proben in 70% Ethanol bei 4 °C, bis das Protokoll zur Fortsetzung bereit ist.HINWEIS: Eine kürzere Inkubationszeit ist besser für die Aufrechterhaltung des GFP-Signals in transgenen Stämmen aufgrund des Abbaus von GFP durch PFA im Laufe der Zeit. Längere Inkubationszeiten ermöglichen es dem Fixiermittel, besser in die Proben zu permeabilisieren. Am besten ist es, die Inkubationszeit in Abhängigkeit von der Probe empirisch zu bestimmen. Entfernen Sie die PFA-Lösung.Die Proben werden in einer Mikrozentrifuge mit der entsprechenden Geschwindigkeit heruntergedreht (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie mit einer Pipette so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören.ACHTUNG: Der Überstand enthält PFA, das giftig ist. Entsorgen Sie den Überstand und mindestens die ersten beiden Waschungen als Giftmüll in einem Abzug. Geben Sie 0,5 ml PBS-T zu den Proben in den Mikrofugenröhrchen. Befolgen und wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 und 1.4.2 2-3x mit PBS-T.HINWEIS: Wenn Sie mehr Waschvorgänge durchführen, wird das Hintergrundsignal reduziert. Insgesamt werden mindestens vier Wäschen empfohlen. Nach der letzten Wäsche die Proben herunterschleudern und den Überstand entfernen, wobei das Pellet ungestört bleibt. Hybridisierungspuffer (HB) vorbereiten und die Nematoden waschenBereiten Sie 1 ml HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01% SDS) pro Probe vor.HINWEIS: HB sollte vor jedem Gebrauch frisch zubereitet werden, um Niederschläge zu vermeiden. Ein allgemeiner Puffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kann jedoch im Voraus hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert werden, bis HB benötigt wird. Vor Gebrauch 1 ml pro Probe des allgemeinen Puffers vorbereiten und SDS zu einer Endkonzentration von 0,01% hinzufügen. 800 μL HB in die Mikrofugenröhrchen geben, die das Nematodenpellet enthalten. Pelletieren Sie die Proben in der Mikrozentrifuge (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Hybridisieren Sie die FISH-Sonde auf die gewünschte ZielsequenzMischen Sie 100 μL pro Probe des vorbereiteten HB mit der gewünschten FISH-Sonde auf eine Endkonzentration von 5-10 ng/μL Sonde.HINWEIS: FISH-Sonden sind 15-23-mer-Oligos, Antisense zur SSU der interessierenden Mikrobe und mit einem farbigen Fluorophor markiert, das am 5′- oder 3′-Ende befestigt ist (siehe Tabelle 1 für hier verwendete Sonden). Im Allgemeinen werden FISH-Standardsonden bei 1 mg/ml gelagert. Fügen Sie jeder Probe 100 μL HB-haltige FISH-Sonde hinzu. Mischen Sie, indem Sie die Röhrchen vorsichtig streichen oder umkehren.HINWEIS: Verschiedene farbige FISH-Sonden können gleichzeitig hinzugefügt werden, um mehrere Fluoreszenzsignale in derselben Probe sichtbar zu machen (siehe Abbildung 1B). Inkubieren Sie die Proben über Nacht (6-24 h) in einem trockenen Bad bei 46-54 °C oder einem thermischen Mischer bei 46-54 °C bei 1.200 U/min.HINWEIS: Die Inkubation bei 46-48 °C wird typischerweise für die Hybridisierung verwendet. Diese Temperatur muss jedoch möglicherweise in Abhängigkeit von der Schmelztemperatur der FISH-Sonde angepasst werden. Im Allgemeinen liegt die Hybridisierungstemperatur 4 °C unter der Schmelztemperatur. Entfernen Sie die FISH-Sonde und waschen Sie Nematoden.Bereiten Sie 3 ml Waschpuffer (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) pro Probe vor.HINWEIS: WB sollte vor jedem Gebrauch frisch zubereitet werden, um Niederschläge zu vermeiden. Ein allgemeiner Puffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kann jedoch im Voraus hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert werden, bis der Waschpuffer benötigt wird. Vor Gebrauch 3 ml pro Probe des allgemeinen Puffers vorbereiten und EDTA zu einer Endkonzentration von 5 mM und SDS zu einer Endkonzentration von 0,01% hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie das HB mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Nematodenpellet ungestört zu lassen. Fügen Sie jeder Probe 1 ml vorbereitetes WB hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie die WB mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet ungestört zu lassen. Fügen Sie jeder Probe 1 ml vorbereitetes WB hinzu. Die Proben werden 1 h bei 48-56 °C in einem trockenen Bad (oder einem thermischen Mischer bei 48-56 °C bei 1200 U/min) inkubiert. Wenn Sie in einem trockenen Bad inkubieren, drehen Sie die Röhrchen alle 15-20 Minuten vorsichtig um.HINWEIS: Im Allgemeinen werden 48 °C als Standardwaschtemperatur verwendet; Diese Temperatur muss jedoch möglicherweise angepasst werden, wenn ein hohes Hintergrundsignal vorhanden ist. Die Waschtemperatur liegt oft 2 °C über der Hybridisierungstemperatur. Die Inkubationszeit in WB kann auf 30 min verkürzt werden, um den Hintergrund weiter zu reduzieren, danach sollten die Schritte 1.7.4 und 1.7.5 wiederholt werden. Es folgen eine (für Bakterien) oder zwei (für Mikrosporidien-Sporoplasmen) 30-minütige Inkubationszeiten bei 48 °C. Zentrifugieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie den Waschpuffer mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet ungestört zu lassen. Fügen Sie 100-500 μL PBS-T zu jeder der Proben hinzu. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bis zu einer Woche in PBS-T bei 4 °C gelagert werden, bis das Protokoll zur Fortsetzung bereit ist. Mount die NematodenZentrifugieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie so viel PBS-T wie möglich, ohne das Nematodenpellet zu stören. (Optional) Fügen Sie 20 μL Antifade-Montagemedium mit DAPI (Table of Materials) zu den Proben hinzu. Laden Sie einen 20-μL-Pipettierer mit einer 200-μL-Pipettenspitze und schneiden Sie die Spitze der Pipette mit einer Schere ab, damit größere Nematoden pipettiert werden können. Mit der geschnittenen Pipettenspitze 5-10 μL des Pellets auf einen Objektträger übertragen. Abdeckung mit einem Deckglas 22 x 22. Zur Aufbewahrung der Objektträger verschließen Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack und bewahren Sie sie in einer dunklen Box bei 4 °C auf, bis sie für die weitere Verwendung bereit sind. 2. FISH-Färbung mit Acetonfixierung Bereiten Sie Nematoden mit zugehörigen Mikroben vor, wie in Schritt 1.1 beschrieben. Nematoden waschen, um externe Verunreinigungen wie in Schritt 1.2 beschrieben zu vermeiden. Nematoden mit Aceton fixierenEntfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie der Probe 1 ml Aceton in Laborqualität hinzu.ACHTUNG: Aceton ist eine leicht entzündliche Flüssigkeit und Dampf. Obwohl es über den Ladentisch als Nagellackentferner gekauft werden kann, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Aceton schwere Augenreizungen verursacht und Schläfrigkeit oder Schwindel verursachen kann. Inkubieren Sie die Proben, die Nematoden enthalten, die mit der interessierenden Mikrobe besiedelt oder infiziert sind, für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation können die Proben bis zu 2 Wochen in Aceton bei -20 °C gelagert werden, bis das Protokoll zur Fortsetzung bereit ist.HINWEIS: Verwenden Sie dieses Protokoll nicht mit transgenen C. elegans-Stämmen, die GFP (oder seine allelisch mutierten Formen) exprimieren, wenn die Fluoreszenz aufrechterhalten werden soll, da Aceton dieses Signal zerstört. Entfernen Sie das AcetonDie Proben werden in einer Mikrozentrifuge mit der entsprechenden Geschwindigkeit heruntergedreht (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie mit einer Pipette den Überstand, ohne das Pellet zu stören.ACHTUNG: Der Überstand enthält Aceton. Entsorgen Sie den Überstand und mindestens die ersten beiden Waschungen als Giftmüll in einem Abzug. Geben Sie 0,5 ml PBS-T zu den Proben in den Mikrofugenröhrchen. Befolgen und wiederholen Sie die Schritte 2.4.1 und 2.4.2 2-4x mit PBS-T.HINWEIS: Wenn Sie mehr Waschvorgänge durchführen, wird das Hintergrundsignal reduziert. Es wird empfohlen, insgesamt vier Wäschen durchzuführen. Nach dem letzten Waschgang die Proben herunterschleudern und den Überstand entfernen, um sicherzustellen, dass das Pellet ungestört ist. Bereiten Sie den Hybridisierungspuffer (HB) vor und waschen Sie die Nematoden wie in Schritt 1.5 beschrieben. Hybridisieren Sie die FISH-Sonde auf die gewünschte Zielsequenz, wie in Schritt 1.6 beschrieben. FISH-Sonde entfernen und Nematoden waschenBereiten Sie 1,1 ml Waschpuffer (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) pro Probe vor.HINWEIS: WB sollte vor jedem Gebrauch frisch zubereitet werden, um Niederschläge zu vermeiden. Ein allgemeiner Puffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kann jedoch im Voraus hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert werden, bis ein Waschpuffer benötigt wird. Vor Gebrauch 1,1 ml pro Probe des allgemeinen Puffers vorbereiten und EDTA zu einer Endkonzentration von 5 mM und SDS zu einer Endkonzentration von 0,01% hinzufügen. Die Proben werden mit der entsprechenden Geschwindigkeit zentrifugiert (siehe Abschnitt 1.1.4). Entfernen Sie das HB mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Nematodenpellet ungestört zu lassen. Fügen Sie jeder Probe 100 μL vorbereitete WB hinzu. Die Proben werden mit der entsprechenden Geschwindigkeit zentrifugiert (siehe Abschnitt 1.1.4). Entfernen Sie die WB mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet ungestört zu lassen. Fügen Sie jeder Probe 1 ml vorbereitetes WB hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 1 h bei 48-56 °C in einem trockenen Bad (oder thermischen Mischer bei 48-56 °C bei 1.200 U/min). Wenn Sie in einem trockenen Bad inkubieren, drehen Sie die Röhrchen alle 15-20 Minuten vorsichtig um.HINWEIS: Im Allgemeinen werden 48 °C als Standardwaschtemperatur verwendet; Diese Temperatur muss jedoch möglicherweise angepasst werden, wenn ein hohes Hintergrundsignal vorhanden ist. Die Waschtemperatur liegt oft 2 °C über der Hybridisierungstemperatur. Zentrifugieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit (siehe Schritt 1.1.4). Entfernen Sie den Waschpuffer mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet ungestört zu lassen. Fügen Sie 100-500 μL PBS-T zu jeder der Proben hinzu. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bis zu einer Woche in PBS-T bei 4 °C gelagert werden, bis das Protokoll zur Fortsetzung bereit ist. Montieren Sie die Nematoden wie in Schritt 1.8 beschrieben.

Representative Results

Für die Analyse von Mikrobiombakterien wurden spezifische und universelle FISH-Sonden zu bakteriellen 16S an wild isolierten Tieren verwendet. Der wilde Caenorhabditis tropicalis-Stamm (JU1848) wurde aus dem Nouragues-Wald in der Nähe eines kleinen Flusses in Französisch-Guayana aus verrottenden Palmenfrüchten entnommen22. Unter dem DIC-Mikroskop (Differential Interference Contrast) wurde festgestellt, dass dieser Nematodenstamm mit einem Bakterium besiedelt ist, das gerichtet am Darmepithel zu haften scheint (Abbildung 2A). JU1848 wurde dann selektiv gereinigt, um andere mikrobielle Verunreinigungen zu eliminieren und für das gewünschte anhaftende Bakteriumanzureichern 23. Mit der universellen PCR-Methode wurde das Bakterium als neue Art in der Klasse der Alphaproteobakterien identifiziert. Eine mit Cal Fluor Red 610 markierte FISH-Sonde wurde dann speziell für die 16S rRNA-Sequenz dieses Bakteriums entwickelt, um eine fluoreszierende Visualisierung der Besiedlung innerhalb von C. tropicalis zu ermöglichen (Abbildung 2B). Eine universelle 16S rRNA FISH-Sonde, die viele Bakterienarten binden kann (EUB338), wurde mit 6-Carboxyfluorescin (FAM) markiert und dieser Probe ebenfalls hinzugefügt. Die grün und rot fluoreszierenden Signale überlappen sich vollständig, was darauf hindeutet, dass die meisten Bakterien, die den Darm besiedeln, das anhaftende Alphaproteobakterien-Bakterium sind. Diese Tiere wurden vor der Färbung in PFA fixiert. Für die Analyse experimenteller Infektionen im Labor mit intrazellulären Krankheitserregern bekannter Identität wurden Orsay-Virus- und Mikrosporidien-spezifische FISH-Sonden an C. elegans mit Wildtyp-Hintergrund verwendet. Das Orsay-Virus ist ein Positivstrang-RNA-Virus aus der Familie der Nodaviridae und der einzige natürliche virale Erreger, der in C. elegans gefunden wird. Das bipartite RNA-Genom des Orsay-Virus besteht aus RNA1- und RNA2-Segmenten, und FISH-Sonden wurden entwickelt, die auf beide Segmente abzielen (Abbildung 3A,B)9,18. Im Darm wird virale RNA durch das RIG-I-Homolog DRH-124 erfasst, das für die Aktivierung des transkriptionellen Abwehrprogramms namens Intracellular Pathogen Response (IPR) benötigt wird 25,26,27. Die Transkription antiviraler IPR-Gene wird zumindest teilweise durch den ZIP-1-Transkriptionsfaktor21 gesteuert. Hier ist die Expression von ZIP-1::GFP in den Darmkernen von Zellen lokalisiert, die eine positive Orsay-Virus-FISH-Färbung im Zytoplasma aufweisen (Abbildung 3A)21. Mehrere Tiere, die mit Orsay-spezifischem FISH gefärbt wurden, zeigen die Stärke dieses Signals für eine einfache Quantifizierung an (Abbildung 3B). Die in Abbildung 3A,B gezeigten Tiere wurden in PFA fixiert. Der Mikrosporidienparasit Nematocida parisii, was Nematoden-Killer aus Paris bedeutet, ist ein obligater intrazellulärer Erreger des Darms. Mehrere FISH-Sonden, die 18S rRNA von N. parisii markieren, wurden verwendet, darunter fluoreszenzmarkierte MicroA- und MicroB-Sonden. Mehrere Tiere, die mit MicroB FISH gefärbt wurden, zeigen die Stärke dieses Signals für eine einfache Quantifizierung an (Abbildung 3C). Zusätzlich ist C. elegans mit anderen eng verwandten Mikrosporidien infiziert. Die Koinfektion von N2 mit N. parisii und dem verwandten N. ausubeli kann anhand dieses FISH-Protokolls unterschieden werden, indem artspezifische FISH-Sonden entworfen werden, die miteinander um die Bindung an eine divergente Region auf der 18S rRNA konkurrieren (Abbildung 3D)28. In diesem Beispiel hat die N. parisii FISH-Sonde eine perfekte Basenpaarung zur N. parisii 18S rRNA, aber eine 7 bp Fehlanpassung an N. ausubeli 18S rRNA. Das Gegenteil gilt für die Sonde N. ausubeli. Als solches wird jede artspezifische FISH-Sonde um die Bindung an die verwandte Art 18S gegenüber der nicht-verwandten Art konkurrieren. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von DAPI zur Färbung von Kernen eine bessere Lokalisation der Infektion im Kontext des gesamten Tieres, insbesondere für den Darm, der große, leicht identifizierbare Kerne aufweist. Abbildung 3C,D enthält Tiere, die in PFA fixiert wurden. Spätere Infektionen mit N. parisii führen zur Entwicklung von Meronten zu Sporen. Um N. parisii-Sporen sichtbar zu machen, müssen die Tiere in Aceton fixiert werden, da es die Sporenwand besser durchdringt als PFA (Abbildung 3E,F)8. Die resultierende FISH-Färbung zeigt die kleinen und großen stäbchenförmigen Strukturen, die wahrscheinlich mit N. parisii-Sporen korrespondieren, die mit N. parisii-spezifischen Sonden rot gefärbt sind. Abbildung 1: Visuelle Darstellung des FISH-Protokolls. Erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: FISH-Färbung eines wilden C. tropicalis JU1848-Stammes, der mit anhaftenden Bakterien im Darm besiedelt ist. (A) Nomarski-Bild, das Tausende von dünnen Bazillenbakterien (Bac) darstellt, die sich gerichtet an den Darm (in) von JU1848 binden und einen haarähnlichen Phänotyp innerhalb des Lumens (lu) erzeugen. Dieses Abbildungspanel stammt aus Morgan, E. et al. (2021)23. (B) FISH-Färbung von JU1848, fixiert in PFA, unter Verwendung einer rot markierten Sonde (b002_16S_A-CF610), die auf die 16S-rRNA-Sequenz des anhaftenden Bakteriums abzielt (oben) und eine grün markierte universelle FISH-Sonde (EUB338-FAM), die auf die 16S von Bakterien abzielt (unten). Die DAPI-Färbung von Wirtskernen ist blau dargestellt. Die Sondensequenzen finden Sie in Tabelle 1 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: FISH-Färbung von C. elegans, die mit intrazellulären Krankheitserregern infiziert sind. (A,B) FISH-Färbung von C. elegans, die ZIP-1::GFP exprimieren und mit dem Orsay-Virus infiziert sind, die vor der Färbung mit PFA fixiert wurden, um das GFP-Signal zu erhalten. Orsay 1 Red und Orsay 2 Red Sonden wurden für die Färbung von Krankheitserregern verwendet. (A) Das zusammengesetzte Bild besteht aus verschmolzenen roten und grünen fluoreszierenden Kanälen. Die nukleare ZIP-1::GFP-Expression wird bei einer Orsay-Virusinfektion induziert und grün dargestellt. Die Autofluoreszenz aus dem Darmgranulat ist gelb dargestellt und mit gelben Pfeilen gekennzeichnet. Gepunktete Linien umreißen den Nematodenkörper. Maßstabsbalken = 25 μm. (B) Das zusammengesetzte Bild besteht aus verschmolzenen roten Fluoreszenz- und DIC-Kanälen. Maßstabsbalken = 200 μm. (C,D) FISH-Färbung von Wildtyp-C. elegans, die mit Mikrosporidien infiziert sind, die in PFA fixiert waren. (C) FISH-Färbung von Wildtyp-C. elegans, die mit N. parisii infiziert und in PFA fixiert sind. MicroB-CF610 Sonde wurde für die Färbung von Krankheitserregern verwendet. Das zusammengesetzte Bild besteht aus verschmolzenen roten Fluoreszenz- und DIC-Kanälen. Maßstabsbalken = 100 μm. (D) FISH-Färbung von Wildtyp C. elegans, koinfiziert mit N. parisii und N. ausubeli im Darm. Die beiden Erreger wurden mit einem Paar spezifischer FISH-Sonden co-gefärbt, die um die Bindung an dieselbe Region der 18S rRNA konkurrieren. N. parisii wurde mit MicroF-CF610 (rot) und N. ausubeli mit MicroSp1A-FAM (grün) gefärbt. Die DAPI-Färbung von Wirtskernen ist blau dargestellt. Maßstabsbalken = 25 μm. (E) FISH-Färbung mit acetonfixierten Wildtyp-C. elegans, die mit N. parisii-Sporen infiziert sind. MicroA-CF610 (rot) wurde zur Färbung (rot) verwendet. Maßstabsbalken = 15 μm. (F) Nomarski-Bild mit N. parisii-Sporen in (E). Maßstabsbalken = 15 μm. In (E) und (F) sind die kleinen und großen stabförmigen Strukturen mit kleinen bzw. großen Pfeilen beschriftet, die N. parisii-Sporen entsprechen. Die Sondensequenzen finden Sie in Tabelle 1. Das in (A) gezeigte Bild stammt aus Lažetić, V. et al. (2022)21. Die in (B) und (C) gezeigten Bilder stammen von Reddy, K. C. et al. (2019)26. Die in (E) und (F) gezeigten Bilder stammen von Troemel, E. R. et al. (2008)8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Name der Sonde Sondenspezifität Sonde Fluorophor Sondensequenz EUB338-FAM Bakterielles 16S (universell) 5′ 6-Fluorescein (FAM) GCTGCCTCCCGTAGGAGT b002_16S_A-CF610 Alphaproteobakterien 16S Cal Fluorrot 610 (CF610) TGTACCGACCCTTAACGTTC Orsay1 Rot Orsay-Virus RNA1 Cal Fluorrot 610 (CF610) GACATATGTGATGCCGAGAC Orsay2 Rot Orsay-Virus RNA2 Cal Fluorrot 610 (CF610) GTAGTGTCATTGTAGGCAGC MicroA-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluorrot 610 (CF610) CTCTGTCCATCCTCGGCAA MicroB-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluorrot 610 (CF610) CTCTCGGCACTCCTTCCTG MicroF-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluorrot 610 (CF610) AGACAAATCAGTCCACGAATT MicroSp1A-FAM Nematocida ausubeli 18S 5′ 6-Fluorescein (FAM) CAGGTCACCCCACGTGCT Tabelle 1: Liste der FISH-Sondensequenzen. Alle FISH-Sonden wurden kommerziell gekauft, wobei das Fluorophor am 5′-Ende befestigt war (durch kundenspezifische Oligonukleotidsynthese; siehe Materialtabelle) und die Oligonukleotide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.

Discussion

Wilde C. elegans sind natürlich mit einer Vielzahl von Mikroben verbunden. Forscher können RNA FISH verwenden, um diese Mikroben zu detektieren und zu identifizieren sowie Einblicke in ihre Lokalisierung im Kontext eines ganzen Tieres zu gewinnen. Mikroben mit wünschenswerten oder interessanten Phänotypen können durch diese Methode identifiziert und dann zur weiteren Charakterisierung und Sequenzierung isoliert werden. Die Häufigkeit zahlreicher Bakterienisolate aus wilden C. elegans kann auch über RNA FISH29 quantifiziert werden. Durch die Verwendung des hier beschriebenen Protokolls ist es auch möglich, bekannte Mikroorganismen in ihren Wirten zu beobachten und mehr über ihre Wechselwirkungen zu erfahren. Wichtig ist, dass Orsay-Virus und Mikrosporidien obligate Parasiten sind und nicht unabhängig vom Wirt kultiviert werden können, so dass FISH das Standard-Visualisierungswerkzeug ist. Besiedlung oder Infektion kann auch durch RNA FISH unter Verwendung von Nematoden quantifiziert werden, die auf Platten gezüchtet werden, die mit einem gewünschten kultivierbaren Bakterium von Interesse gesät sind. Neben der Färbung von Mikroorganismen im Darm von C. elegans kann dieses Protokoll auch für andere Nematodenstämme wie C. tropicalis oder Oscheius tipulae19,23 verwendet werden.

Der Hauptvorteil des FISH-Protokolls besteht darin, dass es eine einfache, schnelle und robuste Methode zum Färben von Mikroben bietet, die mit C. elegans assoziiert sind. Bilder, die durch FISH-Färbung erzeugt werden, haben ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis, das durch die Verwendung von FISH-Sonden erreicht wird, die auf die reichlich vorhandene RNA der SSU in der Probe abzielen. Da es typischerweise 30x oder mehr rRNA-Konzentrationen als rDNA gibt, ist der größte Teil des Signals von FISH-Färbung mit Sonden, die auf rRNA abzielen, auf rRNA und nicht auf rDNA30 zurückzuführen. Darüber hinaus ermöglicht RNA FISH, Infektionen oder Besiedlung im Kontext des gesamten Tieres zu sehen. Diese Visualisierung wird durch die Co-Färbung von Wirtskernen mit DAPI und/oder die Verwendung fluoreszenzmarkierter Stämme von C. elegans erleichtert, um die Lokalisation der Infektion oder Besiedlung innerhalb der Probe besser hervorzuheben. Zum Beispiel wurde mikrosporidian-spezifisches FISH verwendet, um den Gewebetropismus von Nematocida displodere zu bestimmen, indem ein Panel von C. elegans-Stämmen mit GFP-Expression in verschiedenen Gewebenverwendet wurde 20. Darüber hinaus ist dieses Protokoll für Änderungen zugänglich, die es den Forschern ermöglichen, die idealen Bedingungen zu bestimmen, die für ihre spezifischen Bedürfnisse geeignet sind (z. B. Anpassung der Fixierungszeit, Erhöhung der Hybridisierungstemperatur).

Ein kritischer Schritt im FISH-Protokoll ist die Fixierung der Proben. Die Inkubationszeit nach der Zugabe des Fixiermittels ist notwendig, um dem Mittel Zeit zu geben, die Probe zu permeabilisieren. Längere Inkubationszeiten sind aufgrund des Proteinabbaus durch PFA im Laufe der Zeit nicht ideal für Proben, die transgene fluoreszierende Proteine enthalten. Für Proben, die GFP enthalten, ist es unerlässlich, die optimale Fixierungszeit zu bestimmen, um eine Permeabilisierung zu ermöglichen und gleichzeitig das GFP-Signal beizubehalten.

FISH kann verwendet werden, um Bakterien, Viren oder Mikrosporidien in C. elegans zu färben. Die beste Art von Fixiermittel, das für FISH verwendet wird, hängt jedoch von der Probe und den nachgeschalteten Anforderungen ab. Dieses Protokoll stellt eine PFA-Lösung als primäres Fixiermittel zur Färbung von Bakterien und Viren dar. PFA ist jedoch nicht ausreichend für die Visualisierung von Mikrosporidiensporen, da es die Sporenwand nicht durchdringen kann. Zur Visualisierung von Sporen sollte stattdessen Aceton verwendet werden. Die PFA-Fixierung ist jedoch effizient für die FISH-Markierung anderer Lebensstadien von Mikrosporidien, einschließlich Sporoplasmen, Meronten und Sporoten. Andere Hauptunterschiede sind zwischen Acetonfixierung und PFA-Fixierung zu sehen; Aceton ist bequemer, da Proben nach dem Hinzufügen schnell im Gefrierschrank aufbewahrt werden können, ohne dass gewaschen werden muss. Aceton tötet jedoch schnell jedes vorhandene GFP in einem transgenen Wirt. PFA ist das bevorzugte Fixiermittel, wenn es wichtig ist, einige physiologische Strukturen im Wirt zu erhalten, da acetonfixierte Tiere stärker abgebaut zu sein scheinen, was die Identifizierung einiger Gewebe erschwert. Da die Proben fixiert sind, erlaubt dieses FISH-Protokoll keine Live-Bildgebung von Wirt-Mikroben-Interaktionen in vivo. Ein Puls-Chase-Infektionszeitverlauf, gefolgt von einer FISH-Färbung von Proben zu verschiedenen Zeitpunkten, kann es jedoch ermöglichen, eine gewisse Dynamik der mikrobiellen Infektion zu sehen 19,20,31.

Ein weiterer kritischer Schritt im gesamten Protokoll ist das gründliche Waschen der Proben vor und nach der Hybridisierung. Vor der Hybridisierung können beim Sammeln der Würmer in die Mikrofugenröhrchen überschüssige Bakterien oder andere Mikroben von den NGM-Platten mit der Wurmprobe transportiert werden. Drei Waschgänge mit PBS-T sind Standard; Es können jedoch weitere Waschgänge erforderlich sein, um externe Mikroorganismen ausreichend zu eliminieren, insbesondere bei Verwendung stark kontaminierter, wild isolierter C. elegans. Wenn Sie die montierten Proben nach dem FISH betrachten, kann es zu einer verbleibenden FISH-Sonde kommen, die große Signalmengen im Hintergrund der Probe erzeugt. Die Waschtemperatur und die Anzahl der Wäschen sind wichtig, um die überschüssige und unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen. Um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren, ist es möglich, zwei oder drei Wäschen mit 1 ml WB alle 30 min durchzuführen, anstatt eine Wäsche mit 1 ml WB für eine Stunde. Verschiedene FISH-Sonden können unterschiedliche Waschtemperaturen erfordern. Typischerweise liegt die Waschtemperatur 2 °C über der Hybridisierungstemperatur, diese kann jedoch bei zu viel Hintergrundfluoreszenz (hohes Rauschen) erhöht werden.

Das FISH-Protokoll verwendet fluoreszierende Sonden, die auf speziesspezifische mikrobielle RNA abzielen, aber FISH-Sonden können für andere High-Copy-Transkripte entwickelt werden. Andere FISH-Sonden können unterschiedliche Schmelztemperaturen haben, so dass Inkubationsschritte möglicherweise bei einer höheren oder niedrigeren Temperatur als beschrieben durchgeführt werden müssen. Die FISH-Färbung kann die räumliche Verteilung der mikrobiellen Besiedlung oder Infektion innerhalb des Wirts identifizieren und so die Charakterisierung von Wirt-Mikroben- und Mikroben-Mikroben-Interaktionen ermöglichen. Eine Einschränkung besteht darin, dass nur wenige herkömmliche Fluorophore gleichzeitig verwendet werden können, was die Anzahl der verschiedenen Mikroorganismen reduziert, die gleichzeitig über FISH nachgewiesen werden können. Dies schränkt seine Verwendung für komplexe Mikrobiomstudien in C. elegans ein. Mehrfarbige rRNA-zielgerichtete FISH verwendet jedoch Sonden, die mit nicht-kanonischen Fluorophoren markiert sind, die die Anzahl der verschiedenen mikrobiellen Gruppenmarkierungen erhöhen können15. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass es schwierig ist, zwischen eng verwandten Arten zu unterscheiden, insbesondere Bakterien, die SSU-Sequenzen haben, die sehr ähnlich sind. Die extreme Sequenzdivergenz zwischen Mikrosporidien-Arten hilft jedoch, ihre Differenzierung mit diesem Protokoll zu erleichtern (Abbildung 3)32,33.

Insgesamt beschreibt dieses FISH-Protokoll eine Technik zum Nachweis von Mikroorganismen in C. elegans. Es ermöglicht Forschern, ein transparentes und genetisch handhabbares Modellsystem zu verwenden, um Besiedlung und Infektion im Kontext eines intakten Tieres zu erkennen und zu quantifizieren sowie einzigartiges mikrobielles Verhalten oder Morphologie innerhalb des Wirts zu identifizieren. Eine Preprint-Version dieses Manuskripts wurde während der Rezension34 veröffentlicht.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vielen Dank an Dr. Marie-Anne Félix für die Versorgung mit wilden Nematodenstämmen. Diese Arbeit wurde von NSF unter CAREER Grant 2143718 und California State University unter einem CSUPERB New Investigator Award an RJL, NIH unter R01 AG052622 und R01 GM114139 an ERT und von einem American Heart Association Fellowship an VL unterstützt.

Materials

10% SDS Invitrogen AM9822
Acetone Fisher Scientific A-11-1
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) Vectalab NC9524612
EDTA Fisher Scientific S311-500
FISH probes (see Table 1) LGC Biosearch Technologies FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis
KCl Fisher Scientific P217
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
Na2HPO4 Fisher Scientific S375-500
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 50-980-487 CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately
Thermal mixer Eppendorf 5384000020
Tris base Fisher Scientific BP152
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
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References

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Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (185), e63980, doi:10.3791/63980 (2022).
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